Strutture cristallografiche di complessi tra l’Acetilcolinesterasi da Torpedo Californica e quattro nuovi inibitori, potenziali farmaci per l’Alzheimer

E’ stato dimostrato che i sintomi del morbo di Alzheimer sono associati ad un deficit della funzione colinergica a livello celebrale e pertanto l’impiego di inibitori dell’acetilcolinesterasi (AChE) è ancora oggi considerato l’approccio farmacologico più promettente nella terapia sintomatica di questa malattia. Oggetto dello studio è stata la determinazione della struttura cristallografica della TcAChE in complesso con quattro nuovi inibitori, potenziali farmaci per l’Alzheimer. L’AChE è stata isolata e purificata dagli organi elettrici della Torpedo californica, e cristallizzata con il metodo dell’ “hanging drop”. I cristalli sono stati sottoposti alla procedura di “soaking”(incubazione) con quattro nuovi inibitori dell’AChE: la Ganstigmina (CHF-2819; Chiesi farmaceutici S.p.a., Parma, Italia) e l’N1,N8-bisnorcimserina (National Institute of Health, U.S.A.), entrambi inibitori carbammici e l’SPH1371e l’SPH-1373 (Sanochemia Pharmazeutica, Vienna, Austria) entrambi inibitori reversibili. I cristalli dei quattro complessi sono stati caratterizzati mediante un’analisi cristallografica utilizzando come sorgente di raggi X, la luce di Sincrotrone presso “Elettra”, Trieste. I dati di diffrazione sono stati elaborati utilizzando i programmi biocristallografici DENZO, SCALEPACK e CCP4. La struttura 3D è stata determinata mediante il metodo della sostituzione molecolare utilizzando il programma AMoRe. L’affinamento della struttura è stato eseguito utilizzando il programma CNS. Lo studio del complesso con la ganstigmina è stata dettato dal buon profilo farmacodinamico e farmacocinetico del nuovo inibitore. Nella struttura cristallografica si osserva che il gruppo carbammico è legato covalentemente alla serina catalitica, mentre la geneserolina, il gruppo uscente, non è presente in tutto l’enzima, confermando l’ipotesi dell’esistenza di una “porta di servizio” implicata nell’eliminazione dei prodotti di reazione. Questo risultato è stato già suggerito dall’analisi della struttura del complesso con il MF268, un altro inibitore carbammico. I risultati ottenuti hanno permesso di studiare da un punto di vista strutturale le interazioni esistenti tra il gruppo carbammico della ganstigmina ed il sito attivo. La risoluzione della struttura cristallografica ha permesso di studiare da un punto di vista strutturale le interazioni esistenti tra il gruppo carbammico della ganstigmina e la triade catalitica, in particolare l’His440. La lunga durata di azione di questo inibitore può essere attribuita ad una alterazione della funzionalità della triade catalitica. Questa osservazione ha permesso di studiare come l’acetilcolinesterasi possa subire delle modificazioni strutturali importanti ad opera degli inibitori carbammici. L’N1,N8-bisnorcimserina, derivato della fisostigmina è un inibitore ben tollerato in vivo, oltrepassa la barriera emato-encefalica e, saggiata sui roditori, ha rivelato un aumento delle risposte cognitive. Come nel caso del MF268 e della ganstigmina, ci si aspettava di trovare nel sito catalitico una densità elettronica residua attribuibile al gruppo paraisopropilfenilcarbammico legato covalentemente alla serina catalitica. Inaspettatamente, invece, all’interno della gola enzimatica è stata riscontrata una densità residua corrispondente al gruppo uscente, la nor-eserolina, mentre non è stato identificato il gruppo carbammico. Il risultato ottenuto si è rivelato di grande interesse in quanto per la prima volta è stata determinata la struttura della TcAChE in complesso con il gruppo uscente degli inibitori carbammici analoghi della fisostigmina. L’SPH-1371 e l’SPH-1373 sono derivati della galantamina , farmaco già in uso terapeutico con il nome di Reminyl®. Essi sono stati disegnati e sintetizzati con lo scopo di identificare un candidato che presenti migliori capacità inibitorie e proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche superiori a quelle della stessa galantamina. Le strutture cristallografiche dei complessi tra la TcAChE e queste due nuove molecole, hanno evidenziato un differente orientamento dei due gruppi funzionali sostituenti sull’azoto dell’anello tetraidroazepinico della galantamina, fornendo una base razionale per l’interpretazione delle loro rispettive proprietà farmacologiche. Il sostituente propilpiperidinico dell’SPH-1371, ha mostrato un orientamento nella gola catalitica dell’AChE del tutto inatteso e in disaccordo con le previsioni ottenute da studi di molecular modelling. La struttura del complesso con l’inibitore SPH-1373, ha mostrato che la catena alchilica, costituita da sei gruppi metilenici e funzionalizzata con un gruppo saccarinico, assume una conformazione estesa all’interno della gola enzimatica e presenta una interazione di tipo π-π con il Trp279 del Peripheral Anionic Site, situato all’ingresso della cavità enzimatica. Con l’analisi strutturale è stato possibile interpretare razionalmente i buoni valori delle attività inibitorie mostrati da questi due composti. Le strutture cristallografiche dei complessi TcAChE-inibitori presentate hanno permesso di razionalizzare le proprietà farmacologiche delle molecole utilizzate e nel loro complesso costituiscono una solida base di partenza per i successivi studi di molecular modelling e drug design.