Sistemi integrati di analisi molecolare per la diagnosi e lo studio delle malattie da triplette instabili

Repeat instability is an important and unique form of mutation that is linked to more than 40 neurological, neurodegenerative and neuromuscular disorders. Such diseases are classified in three different groups on the basis of pathogenic mechanisms: 1) loss of gene function; 2) altered protein function; 3) toxic effects at the mRNA level. During the period of my doctoral, I studied in depth a disease-model for each class: 1) Fragile X Syndrome, caused by a [CGG] expansion in 5’ UTR of the fragile X mental retardation 1 gene (FMR1); 2) Autosomal Dominant Cerebellar Ataxia (ADCA), caused by expansion of a translated [CAG] repeat in the respective genes; 3) Myotonic Dystrophy 1 and 2 (DM1, DM2) due to a [CTG] trinucleotide expansion in the 3’ UTR of dystrophia myotonica protein kinase gene (DMPK) and [CCTG] tetranucleotide expansion in intron 1 of zinc-finger protein 9 gene (ZNF9), respectively. In our laboratory we have acquired a great experience in the molecular diagnosis of expansion diseases. Thanks to the innovative technologies and the new discovers in scientific field, we could integrate classical methods with new self-made protocols. Among patients analysed during the period from 2002 to 2005, 275 postnatal and 5 prenatal diagnosis were carried out for patients with clinic symptoms of Fragile-X. The suspect was confirmed just in 34 cases. In the same period we screened 120 Italian patients with permanent and progressive ataxia for all repeat expansions (SCA1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 12, 17, DRPLA) and also for point mutations of FGF-14, PRKCG (SCA14) and CACNA1A (EA2) gene. Fragile X premutation and Friedreich Ataxia (FRDA) repeat were also tested. The results confirmed the variant distribution in Italy of several ADCAs and showed that the rate of molecular diagnosis in ataxic patients with an affected parent can be increased by testing for SCA14, EA2 point mutations and FRDA expansion. On the contrary testing sporadic cases for ADCA mutations appears to account for about 4% of cases, suggesting that such testing should be limited to cases with a very typical phenotype. As regard DM, we diagnosed 755 postnatal and 31 prenatal cases. Among the postnatal diagnosis we identified 84 patients with an expansion in class E1, 156 in E2 and 87 in E3. 327 patients resulted negative to DM1. The DM2 expansion was tested in 160 cases and it was confirmed in 56 patients. These data summed to collected in the past ten years in our laboratory, gave me the possibility to study intergenerational transmission of expansion mutation and the variability of the [CTG] repeat in the same patients. In the last chapter I described a combined bionformatic/molecular approach to the identification of a putative gene for DM3, mapping on chromosome 15 in the region between microsatellites D15S970 and D15S114. A cybernetic screening led to the identification of the ZNF291 as a candidate gene. This gene posses an unstable [CCTG] repeat in its second intron and it is highly expressed in different areas of human brain, in muscle and heart tissues. We have also developed a Southern protocol for the detection of a possible DM3 expansion in non DM1-DM2 patients with a classical DM phenotype. A similar approach could be easily applied on the entire human genome and represents a powerful tool to identify genes candidate for repeat expansion disorders.

L’instabilità genetica di repeat nucleotidici è una forma, importante e unica, di mutazione associata a più di 40 patologie neurologiche, neurodegenerative e neuromuscolari. Tali malattie sono classificate in tre differenti gruppi sulla base del meccanismo patogenetico che porta all’insorgere della malattia stessa: 1) perdita di funzione del gene; 2) funzione alterata della proteina; 3) effetto tossico dell’mRNA. Durante il periodo di dottorato, ho studiato in modo più approfondito un modello-malattia per ciascuna classe: 1) Sindrome dell’X-Fragile, causata da un’espansione [CGG] nel 5’ UTR del gene FMR1 (fragile X mental retardation 1); 2) Atassie Cerebellari Autosomiche Dominanti (ADCA), causate da un’espansione [CAG] in una regione tradotta, presente all’interno dei rispettivi geni-malattia; 3) Distrofia Miotonica 1 and 2 (DM1, DM2) dovute rispettivamente all’espansione di un trinucleotide [CTG] nel 3’ UTR del gene DMPK (dystrophia myotonica protein kinase gene) e di un tetranucleotide [CCTG] nell’introne 1 del gene ZNF9 (zinc-finger protein 9). Il nostro laboratorio vanta una notevole esperienza nella diagnosi molecolare delle malattie da espansione. Grazie alle tecnologie innovative e alle nuove scoperte in campo scientifico, è stato possibile integrare i metodi classici con nuovi protocolli da noi sviluppati. Tra i pazienti analizzati durante il periodo compreso tra il 2002 e il 2005, sono state effettuate 275 diagnosi postnatali e 5 diagnosi prenatali in pazienti con una sintomatologia caratteristica dell’X-Fragile. Il sospetto clinico è stato confermato in 34 casi. Nello stesso periodo di tempo abbiamo screenato 120 pazienti di origine italiana con atassia permanente e progressiva, per tutte le forme di SCA dovute ad espansione (SCA1, 2, 3, 6, 7, 8, 10, 12, 17, DRPLA) e anche per la presenza di mutazioni puntiformi a carico dei geni FGF-14, PRKCG (SCA14) e CACNA1A (EA2). Inoltre, tali soggetti sono stati analizzati per la premutazione nel gene FMR1 e l’atassia di Friedreich. I risultati confermano i dati già pubblicati, relativi alla distribuzione in Italia delle diverse forme di ADCA, mostrando che la frazione di diagnosi molecolari positive nei pazienti atassici con un genitore affetto può essere aumentata inserendo tra i test genetici anche la ricerca di mutazioni puntiformi per la SCA14, EA2 e dell’espansione che caratterizza la FRDA. Al contrario, l’indagine molecolare estesa ai casi sporadici appare risolutiva solo nel 4% dei casi, suggerendo che il test dovrebbe essere limitato soltanto a quei pazienti che presentano un fenotipo caratteristico e indubbio. Per quanto riguarda la DM, abbiamo eseguito 755 diagnosi postnatali e 31 diagnosi prenatali. Tra le prime abbiamo identificato 84 pazienti con espansione di classe E1, 156 di classe E2 e 87 di classe E3. 327 pazienti sono risultati negativi alla DM1. L’espansione DM2 è stata testata in 160 casi ed è stata individuata in 56 pazienti. Questi dati, uniti a quelli raccolti nel nostro laboratorio in 10 anni di attività diagnostica, hanno dato la possibilità di studiare la trasmissione inter-generazionale della mutazione e la variabilità del repeat [CTG] nello stesso paziente. Nell’ultimo capitolo, ho descritto un approccio combinato bioinformatico/molecolare per l’identificazione di un possibile gene candidato per la DM3, che mappa sul cromosoma 15 in una regione compresa tra i microsatelliti D15S970 and D15S114. Uno screening cibernetico, ha portato all’identificazione del gene ZNF291 come il possibile gene candidato. Questo gene presenta un repeat instabile [CCTG] nel secondo introne ed è altamente espresso in differenti aree del cervello umano, nel tessuto muscolare e cardiaco. È stato inoltre messo a punto un protocollo di Southern Blot per lo studio di un’eventuale espansione DM3 in pazienti non DM1-DM2 con un tipico fenotipo DM. Un approccio simile potrebbe essere facilmente applicato all’intero genoma umano e rappresenta un potente mezzo per l’identificazione di geni candidati per malattie da espansione.