Gene expression profiling of mycobacterium tuberculosis and human macrophage during host-pathogen interaction

Macrophages play an essential role in the immune response to Mycobacterium tuberculosis (Mtb), but Mtb evolved effective mechanisms to survive most macrophage effector functions and it can persist within macrophage longtime. The study of transcriptional response to infection of both host and pathogen, should be interesting to better understand this interaction. To this aim we analyzed, at transcriptional level, the relationship of virulent Mtb and human macrophages after 7 days of infection by macroarrays technique. We set up the experimental procedure to enrich in mycobacterial RNA the total RNA extracted from Mtb-infected cells. We optimized also, the reverse transcription process for Mtb cDNA generation, using Mtb specific primers. Then, we studied simultaneously the gene expression profile of the host and the pathogen. We analyzed the alterations in intracellular Mtb, respect to Mtb grown in synthetic medium, using a macroarray with the whole Mtb genome and the gene expression profile of infected macrophages, versus uninfected ones, using a macroarray containing 858 human genes involved in immunoregulation. The global Mtb transcriptome described in this study suggests an intracellular Mtb that actively sense and adapt itself to hostile environment. On the other hand, human macrophages up-regulate, mainly, genes encoding for molecules with a chemotactic role, indicating their maintenance of capacity to recruit other cells at the site of infection, after 7 days of interaction with the pathogen. The data for a selected group of the modulated genes were confirmed by real-time polymerase chain reactions (PCR). In this context we developed a more sensitive and more specific SYBR Green real-time PCR assay to detect rare and GC-rich mycobacterial mRNAs from infected samples.

I macrofagi giocano un ruolo essenziale nella risposta immune a Mycobacterium tuberculosis (Mtb), ma Mtb ha evoluto una serie di meccanismi per superare le risposte macrofagiche e può sopravvivere a lungo all’interno del macrofago umano. Lo studio della risposta trascrizionale all’infezione sia dell’ospite che del patogeno, potrebbe essere interessante per conoscere meglio questa interazione. Con questo scopo noi abbiamo analizzato, a livello trascrizionale, la relazione tra virulento Mtb e macrofago umano dopo 7 giorni di infezione, usando la tecnica del macroarray. Noi abbiamo settato una procedura sperimentale per arricchire di RNA micobatterico, l’RNA totale estratto dalle cellule infettate. Inoltre abbiamo ottimizzato il processo di retrotrascrizione per la generazione del cDNA di Mtb, usando primers specifici per il batterio. Quindi abbiamo analizzato le alterazione di Mtb intracellulare rispetto a Mtb cresciuto in un terreno di coltura sintetico, usando un macroarray con l’intero genoma di Mtb, e abbiamo studiato il profilo di espressione genica dei macrofagi infettati, rispetto ai non infettati, usando un macroarray contenente 858 geni umani coinvolti in processi immunoregolatori. L'analisi globale del trascrittoma di Mtb descritta in questo studio evidenzia un batterio che sente attivamente l’ambiente che lo circonda e che si adatta alle condizioni ostili intracellulari. Dal punto di vista del macrofago, invece, l’infezione determina un’up-regolazione di geni codificanti principalmente molecole con ruolo chemotattico, indicando che il macrofago umano mantiene, dopo 7 giorni di interazione col patogeno, la propria capacità di reclutare altre cellule al sito di infezione. I dati di alcuni geni ottenuti dall’ array sono stati confermati in real-time polymerase chain reactions (PCR). In questo contesto noi abbiamo sviluppato un saggio SYBR Green real-time PCR più specifico e sensibile per rilevare mRNAs micobatterici, rari e ricchi in GC, da campioni di cellule infettate.