ΔNp63 controls hyaluronic acid metabolism and signaling in head and neck squamous cell carcinoma

p63 is a transcription factor belonging to the p53 family. Like other members of the p53 family, the TP63 gene is expressed as multiple isoforms arising by either alternative promoter usage or differential splicing events at the C-terminus. Particularly, the ΔN proteins, although lack the canonical transcriptional activation domain, are endowed with an alternative transactivation domain and promote cancer cell survival and tumor progression in squamous cell carcinomas (SCCs) of different origins. By combining RNA-seq approach with co-expression studies in human primary tumors, we identified and characterized the hyaluronan synthase 3 (Has3), the hyaluronidase 1 and 3 (Hyal1 and 3), and CD44 as novel ∆Np63 regulated genes. Has3 catalyzes the synthesis of hyaluronic acid (HA), while Hyal1 and Hyal3 catalyze the degradation of HA. CD44 is the main signal-transducing HA plasma membrane receptor. We found that in HNSCC cell lines of different origin, ∆Np63 silencing decreased Has3 expression and concomitantly increased the expression of Hyal1 and Hyal3, resulting in the inhibition of the extracellular level of HA. Mechanistically, we found that ∆Np63 directly bound to and activated the promoter of Has3 and, conversely, bound to the promoter and the 3’-terminal region of Hyal3 and 1, respectively, resulting in the repression of gene expression. Accordingly, in several primary squamous tumor datasets, we found that the expression of p63 was positively correlated with that of Has3. HA-mediated signaling is mediated through its interaction with plasma membrane receptors, including primarily CD44. We found that in tumor cells, ∆Np63 silencing decreased CD44 expression and, accordingly, the expression of p63 was positively correlated with that of CD44 in primary squamous tumor data sets. Mechanistically, we found that ∆Np63 directly bound to and activated the promoter of CD44. HA-CD44 interaction is important for mediating chemoresistance by sustaining the full activation of several tyrosine kinase receptors (EGFR, ErbB2 and IGFR) and promoting the expression of ABC drug transporters. We found that ∆Np63, through its action on HA metabolism and CD44 abundance, regulated the tyrosine kinase receptors activation and ABC drug transporter expression, mediating thus, tumor chemoresistance. Notably, in vitro ∆Np63-depletion, similar to Has3 silencing and HA-synthesis inhibition by 4-MU treatment, reduced cancer cell chemoresistance, indicating the ∆Np63 ability to promote chemoresistance in a HA-dependent manner. Moreover, in different human tumors data sets, the positive correlation between p63 and Has3 expression was a negative prognostic factor on HNSCC patient survival, suggesting that the ΔNp63/HA signaling axis is an important determinant of the p63-driven tumorigenesis.

La famiglia di p53 comprende i tre fattori di trascrizione p53, p63 e p73. Il capostipite della famiglia, p53, è definito il “guardiano del genoma”, grazie alla sua abilità di arrestare il ciclo cellulare in presenza di danno al DNA, consentendone una adeguata riparazione e, nell’eventualità che tale danno non possa essere riparato, promuovere la morte cellulare per apoptosi. p53, dunque, agisce funzionalmente come un classico soppressore di tumore. Infatti, mutazioni con perdita di funzione colpiscono il gene p53 nel 50% circa dei tumori umani. Dopo circa vent’anni di studi intensivi su p53, arrivò, inaspettatamente, la scoperta dei due suoi “parenti” stretti, ad alta omologia di sequenza: p73 e p63. Il gene p63 codifica per le isoforme TAp63, dotate del dominio di trans-attivazione all’N-terminale e, grazie ad un secondo promotore, le isoforme ∆Np63, prive di tale dominio ma, comunque, in grado di trans-attivare i propri geni target attraverso un secondo dominio di trans-attivazione. Inoltre, meccanismi di splicing alternativo all’estremità 3’ terminale, generano isoforme C-terminali. Mentre l’isoforma TA “mima” la funzione oncosoppressiva del parente p53, ∆Np63 mostra una spiccata attività oncogenica, in particolare nei carcinomi a cellule squamose di diversa origine, dove risulta altamente espresso. Infatti, ∆Np63 esibisce una notevole abilità nel regolare la trascrizione di molti geni target coinvolti nelle principali caratteristiche biologiche del tumore, tra le quali crescita, evasione dall’apoptosi, migrazione, invasione ed angiogenesi. Nel seguente studio, sveliamo un nuovo programma trascrizionale orchestrato dall’isoforma oncogenica ∆Np63 e che vede come co-protagostista l’acido ialuronico e la sua attività pro-tumorale. L’acido ialuronico, uno dei maggiori costituenti della matrice extracellulare, si comporta da ligando di specifici recettori di membrana plasmatica, tra i quali il CD44, attivandoli ed “accendendo” pathways coinvolti nella crescita, migrazione, invasione e sopravvivenza cellulare. Come atteso, molti tipi tumorali sfruttano la segnalazione dell’acido ialuronico per promuovere la loro crescita, sopravvivenza ed, in fine, la loro chemioresistenza. In particolare, l’interazione tra l’acido ialuronico e il CD44 favorisce l’attivazione dei recettori tirosina chinasi, tra i quali l’EGFR, e dei loro pathways oncogenici. Inoltre, l’attivazione del CD44 da parte dell’acido ialuronico, promuove l’espressione dei trasportatori ABC ed il conseguente efflusso degli agenti chemioterapici presenti nella cellula. Nel nostro studio, mostriamo la sorprendente abilità di ∆Np63, in cellule tumorali, di regolare positivamente il signaling dell’acido ialuronico, agendo sui livelli dell’acido ialuronico e del suo principale recettore CD44. Infatti, ∆Np63 è in grado di indurre direttamente l’espressione della sintasi 3 dell’acido ialuronico (Has3), coinvolta nella sintesi dell’acido ialuronico e, reprimere quella delle ialuronidasi 1 e 3 (Hyal1 e 3), implicate nella degradazione dell’acido ialuronico, determinando un aumento dei livelli extracellulari di acido ialuronico. Inoltre, ∆Np63 direttamente transattiva il gene CD44, auementandone i livelli proteici. In accordo con tali evidenze in vitro, in diversi datasets di tumori primari di origine squamosa, troviamo che l’espressione di p63 correla positivamente con quella di Has3 e CD44. Conseguentemente, osserviamo un’attivazione dell’EGFR e un aumento dei livelli dei trasportatori ABC, guidati dall’asse ∆Np63/acido ialuronico. Infine, dimostriamo la capacità di ∆Np63 di promuovere la chemioresistenza in maniera dipendente dall’acido ialuronico. Infatti, la deplezione di p63, similmente a quella di Has3 e all’inibizione chimica della sintesi dell’acido ialuronico, riduce la resistenza delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici. Inoltre, in data sets di tumori umani, la correlazione positiva tra l’espressione di p63 e Has3 risulta essere un fattore prognostico negativo sulla probabilità di sopravvivenza dei pazienti, suggerendo la crucialità dell’asse p63/acido ialuronico nella tumorigenesi guidata da p63 nei carcinomi squamosi di testa e collo.