Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of autosomal recessive disorder caused by the deficiency of a steroidogenic enzyme involved in corstisol or aldosterone biosynthesis. 21-hydroxylase deficiency (21-OHD) is the most common form, accounting for 90-95% of cases. 21-hydroxylase is a cytocrome P-450 enzyme that catalyzes the conversion of 17-hydroxyprogesterone to 11-deoxycortisol, a precursor of cortisol, and the conversion of progesterone to deoxycorticosterone, a precursor of aldosterone. The phenotype of CAH varies greatly, depending of the degree in the impairment of 21-OH activity. The 21-hydroxylase gene (CYP21A”) is a part of a complicated structure located in the human leukocyte antigen class III locus on chromosome 6p21.3. In the same locus, is present a 98% identical pseudogene (CYP21A1P), which does not encode a functionally active protein due to numerous deleterious mutations; most mutations causing 21-OH deficiency arise from recombinations between CYP21A2 and CYP21A1P. When deleterious sequences normally present in the pseudogene are transferred to the active gene, the latter becomes incapable of encoding a normal enzyme: only 5% are novel CYP21A2 mutations, in which functional analysis of mutant enzymes have been helpful to correlate genotype-phenotype. We have found five novel point mutations (L122P, M150R, Q481X ,E161X and R366H ) in five Italian patients with CAH. To verify the status of the point mutations in CYP21A2 gene as disease-causing mutations and to classify them according to severity, we have constructed in vitro the mutations of CYP21A2 and evaluated the activities of the mutant enzymes after expression in COS7 cells. Molecular modeling suggests a major impact on 21-hydroxylase activity and functional analysis after expression in COS-7 cells confirms reduced enzymatic activity of the mutant enzymes. Only the M150R and R366H mutations affected the activity to a minor extent, probably associated with NC CAH.

La sindrome adrenogenitale(SAG) è un gruppo di disordini autosomici recessivi dovuti a . deficit enzimatici nella steroidogenesi di cortisolo e aldosterone. Il deficit da 21-idrossilasi (21 OHD) è la forma più comune, interessa circa il 90 95% dei casi. La 21-idrossilasi è un’enzima che appartiene alla famiglia dei citocromi P-450 che catalizza la conversione del 17 idrossiprogesterone in 11 deossicortisolo, un precursore del cortisolo e la conversione del progesterone in deossicorticosterone, un precursore dell’aldosterone. Il fenotipo della sindrome adrenogenitale varia a seconda dell’ attività della 21-idrossilasi. Il gene della 21-idrossilasi (CYP21A2) e` localizzato nel complesso maggiore di istocompatibilita` umano di classe 3 sul cromosoma 6. Sullo stesso locus è presente uno pseudogene (CYP21AP),identico per il 98% al gene, che codifica per una proteina non attiva a causa di numerose mutazioni deleterie; la maggior parte delle mutazioni sono causate da ricombinazioni tra CYP21A2 e CYP21AP: solo il 5% sono nuove mutazioni del gene CYP21A2 che non originano dallo pseudogene , nel quale l’analisi funzionali dell’enzima è stato considerato utile per la correlazione genotipo fenotipo. Quando le sequenze deleterie, normalmente presenti nello pseudogene, sono trasferite al gene attivo, quest’ultimo diventa incapace di codificare per una proteina con attività funzionale, Generalmente, e` stata dimostrata una buona correlazione tra genenotipo-fenotipo e la forma clinica correla con l`allele mutato con attivita` enzimatica piu`alta. Questo ha reso possibile predire un inquadramento clinico in soggetti affetti basandosi sul genotipo. Per le nuove e rare mutazioni, in cui non erano disponibili informazioni cliniche e il fenotipo non coincideva con il genotipo,in particolar modo per i pazienti maschi e doppi eterozigoti, solo studiando le attivita` funzionali degli enzimi, ha reso possibile classificare le mutazioni in base alla severita’ della malattia. Abbiamo trovato 5 nuove mutazioni puntiformi (L122P, M150R, Q481X ,E161X and R366H ) in 5 pazienti italiani con SAG. Per verificare le mutazioni presenti sul gene CYP21A2 e per classificarle in base alla gravità, abbiamo costruito in vitro le mutazioni del CYP21A2 e abbiamo considerato le attività enzimatiche mutanti dopo averle fatte esprimere nelle cellule COS7. Il modelling molecolare suggerisce un impatto maggiore sull’ analisi funzionale e strutturale della 21-idrossilasi dopo l’espressione nelle cellule COS-7 confermando una attività enzimatica ridotta Solo le mutazioni M150R e R366H influenzano in minor modo l’ attività enzimatica probabilmente associata con la forma non classica di SAG.

Mrak, E. (2009). Analisi strutturale e funzionale di 5 nuove mutazioni del gene CYP21A2 in pazienti affetti da deficit della 21 idrossilasi.

Analisi strutturale e funzionale di 5 nuove mutazioni del gene CYP21A2 in pazienti affetti da deficit della 21 idrossilasi

MRAK, ELISABETTA
2009-08-05

Abstract

La sindrome adrenogenitale(SAG) è un gruppo di disordini autosomici recessivi dovuti a . deficit enzimatici nella steroidogenesi di cortisolo e aldosterone. Il deficit da 21-idrossilasi (21 OHD) è la forma più comune, interessa circa il 90 95% dei casi. La 21-idrossilasi è un’enzima che appartiene alla famiglia dei citocromi P-450 che catalizza la conversione del 17 idrossiprogesterone in 11 deossicortisolo, un precursore del cortisolo e la conversione del progesterone in deossicorticosterone, un precursore dell’aldosterone. Il fenotipo della sindrome adrenogenitale varia a seconda dell’ attività della 21-idrossilasi. Il gene della 21-idrossilasi (CYP21A2) e` localizzato nel complesso maggiore di istocompatibilita` umano di classe 3 sul cromosoma 6. Sullo stesso locus è presente uno pseudogene (CYP21AP),identico per il 98% al gene, che codifica per una proteina non attiva a causa di numerose mutazioni deleterie; la maggior parte delle mutazioni sono causate da ricombinazioni tra CYP21A2 e CYP21AP: solo il 5% sono nuove mutazioni del gene CYP21A2 che non originano dallo pseudogene , nel quale l’analisi funzionali dell’enzima è stato considerato utile per la correlazione genotipo fenotipo. Quando le sequenze deleterie, normalmente presenti nello pseudogene, sono trasferite al gene attivo, quest’ultimo diventa incapace di codificare per una proteina con attività funzionale, Generalmente, e` stata dimostrata una buona correlazione tra genenotipo-fenotipo e la forma clinica correla con l`allele mutato con attivita` enzimatica piu`alta. Questo ha reso possibile predire un inquadramento clinico in soggetti affetti basandosi sul genotipo. Per le nuove e rare mutazioni, in cui non erano disponibili informazioni cliniche e il fenotipo non coincideva con il genotipo,in particolar modo per i pazienti maschi e doppi eterozigoti, solo studiando le attivita` funzionali degli enzimi, ha reso possibile classificare le mutazioni in base alla severita’ della malattia. Abbiamo trovato 5 nuove mutazioni puntiformi (L122P, M150R, Q481X ,E161X and R366H ) in 5 pazienti italiani con SAG. Per verificare le mutazioni presenti sul gene CYP21A2 e per classificarle in base alla gravità, abbiamo costruito in vitro le mutazioni del CYP21A2 e abbiamo considerato le attività enzimatiche mutanti dopo averle fatte esprimere nelle cellule COS7. Il modelling molecolare suggerisce un impatto maggiore sull’ analisi funzionale e strutturale della 21-idrossilasi dopo l’espressione nelle cellule COS-7 confermando una attività enzimatica ridotta Solo le mutazioni M150R e R366H influenzano in minor modo l’ attività enzimatica probabilmente associata con la forma non classica di SAG.
A.A. 2008/2009
Biotecnologie mediche e medicina molecolare
21.
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of autosomal recessive disorder caused by the deficiency of a steroidogenic enzyme involved in corstisol or aldosterone biosynthesis. 21-hydroxylase deficiency (21-OHD) is the most common form, accounting for 90-95% of cases. 21-hydroxylase is a cytocrome P-450 enzyme that catalyzes the conversion of 17-hydroxyprogesterone to 11-deoxycortisol, a precursor of cortisol, and the conversion of progesterone to deoxycorticosterone, a precursor of aldosterone. The phenotype of CAH varies greatly, depending of the degree in the impairment of 21-OH activity. The 21-hydroxylase gene (CYP21A”) is a part of a complicated structure located in the human leukocyte antigen class III locus on chromosome 6p21.3. In the same locus, is present a 98% identical pseudogene (CYP21A1P), which does not encode a functionally active protein due to numerous deleterious mutations; most mutations causing 21-OH deficiency arise from recombinations between CYP21A2 and CYP21A1P. When deleterious sequences normally present in the pseudogene are transferred to the active gene, the latter becomes incapable of encoding a normal enzyme: only 5% are novel CYP21A2 mutations, in which functional analysis of mutant enzymes have been helpful to correlate genotype-phenotype. We have found five novel point mutations (L122P, M150R, Q481X ,E161X and R366H ) in five Italian patients with CAH. To verify the status of the point mutations in CYP21A2 gene as disease-causing mutations and to classify them according to severity, we have constructed in vitro the mutations of CYP21A2 and evaluated the activities of the mutant enzymes after expression in COS7 cells. Molecular modeling suggests a major impact on 21-hydroxylase activity and functional analysis after expression in COS-7 cells confirms reduced enzymatic activity of the mutant enzymes. Only the M150R and R366H mutations affected the activity to a minor extent, probably associated with NC CAH.
analisi funzionale; struttura; attività enzimatica; CYP21A2; sindrome adrenogenitale; modelling molecolare
Settore BIO/12
Italian
Tesi di dottorato
Mrak, E. (2009). Analisi strutturale e funzionale di 5 nuove mutazioni del gene CYP21A2 in pazienti affetti da deficit della 21 idrossilasi.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Mrak Elisabetta tesi.pdf

accesso aperto

Dimensione 2.4 MB
Formato Adobe PDF
2.4 MB Adobe PDF Visualizza/Apri

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/2108/986
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact