Inhibition of telomerase and hypoxia-inducible factor-1 in human glioblastoma multiforme

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common and the most aggressive glial tumor. It is composed by a heterogeneous tumor cell population, poorly differentiated. GBM (WHO grade IV) develop from low grade astrocytoma (WHO grade I or II) or anaplastic astrocytoma (WHO grade III), but more frequently they arise de novo. GBM tumors are paradigmatic in their ability to induce neo-angiogenesis, a fundamental process in the growth of solid tumors. Of note, endothelial cells of GBM have the peculiarity to reactivate telomerase, the enzyme necessary to maintain telomere length. Telomerase reactivation is a characteristic feature of tumor endothelial cells, since it was not observed in endothelial cells proliferating in non neoplastic contexts. One of the most important regulators of angiogenic processes is the transcriptional factor HIF-1, which orchestrates cellular response to hypoxia. Although HIF-1 is universally recognized as a key factor in inducing neo-angiogenesis as a response to reduced oxygen levels, the consequences of HIF-1 inhibition on the growth of solid tumors are not fully elucidated. The aim of my PhD studies was to explore the consequences of targeting angiogenesis on the development of human GBM. To address this purpose, I selected two parallel strategies: inhibition of telomerase expression in tumor endothelial cells and inhibition of HIF-1 in glial tumor cells. We developed a controlled in vivo assay of tumor angiogenesis in which primary human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) were subcutaneously grafted with or without human GBM cells in immunocompromised mice as Matrigel implants. We found that primary HUVECs did not survive in Matrigel implants, and that telomerase up regulation had little effect on HUVEC survival. In the presence of GBM cells, however, the grafted HUVECs not only survived in Matrigel implants but developed tubule structures that integrated with murine microvessels. Telomerase up regulation in HUVECs enhanced such effect. More importantly, inhibition of telomerase in HUVECs completely abolished tubule formation and greatly reduced survival of these cells in the tumor xenografts. In the second part of this study, we investigated the consequence of downregulating HIF-1 function in a human GBM cell line on cell proliferation in vitro and tumor growth in vivo. RNA interference targeting the O2-regulated HIF-1α subunit efficiently reduced HIF-1α expression and transcriptional induction of HIF-1α responsive genes. In vitro proliferation rate of HIF-1 α - inhibited cells was not altered. Conversely long term co-cultures of wild type and HIF-1 α - inhibited GBM cells resulted in the overgrowth of the wild type cells. Subcutaneous grafting in nude mice of wild type and HIF-1 α - inhibited GBM cells lead to comparable tumor formation and growth. Surprisingly, co-grafting of HIF-1-positive and HIF1-negative GBM cells resulted in more aggressive tumors, both in terms of tumor appearance and tumor growth. This suggests that heterogeneity of the cellular populations in their ability to mount a response to hypoxia may promote tumor aggressiveness.

Il glioblastoma multiforme (GBM), il più comune e aggressivo dei tumori gliali, è composto da una popolazione eterogenea di cellule tumorali astrocitarie scarsamente differenziate. Questi tumori possono svilupparsi dall’evoluzione maligna di un astrocitoma di più basso grado (grado WHO I o II) o da un astrocitoma anaplastico (grado WHO III), ma più frequentemente si manifestano de novo, senza alcuna evidenza di una neoplasia precedente. Il GBM è un tumore paradigmatico nella capacità di indurre neo-angiogenesi, processo necessario per la crescita dei tumori solidi. Le cellule endoteliali del GBM hanno la peculiarità di riattivare la telomerasi, enzima deputato al mantenimento dei telomeri. Questa riattivazione della telomerasi da parte delle cellule endoteliali è una caratteristica esclusiva delle cellule endoteliali tumorali: l’attività telomerasica, infatti, non è stata mai osservata in cellule endoteliali che proliferano in contesti di neoangiogenesi non neoplastica. Uno dei regolatori piu' importanti dei processi angiogenetici è il fattore di trascrizione HIF-1, che coordina la risposta cellulare all’ipossia. Sebbene HIF-1 sia universalmente riconosciuto come un fattore chiave nell’induzione della neo-angiogenesi come risposta all’ipossia, le conseguenze di una sua inibizione nello sviluppo dei tumori solidi non sono ancora del tutto chiare. Lo scopo dei miei studi di dottorato è stato quello di esplorare le conseguenze dell’inibizione dell’angiogenesi sullo sviluppo del GBM umano. A tale scopo, ho deciso di seguire due strategie parallele: l’inibizione della telomerasi nelle cellule endoteliali del tumore e l’inibizione di HIF-1 nelle cellule tumorali gliali. Tramite un modello di angiogenesi neoplastica in vivo, messo a punto nel nostro laboratorio, siamo stati in grado di dimostrare che le cellule endoteliali umane primarie HUVEC, indipendentemente dall’espressione di attività telomerasica, non crescono e non sopravvivono se iniettate nel sottocute murino. Al contrario, se le stesse cellule sono coiniettate insieme al GBM nel sottocute del topo, si evidenzia un significativo aumento della loro sopravvivenza. Inoltre, in questo modello sperimentale, le HUVEC collaborano con le cellule endoteliali dell’ospite per formare i neovasi associati al tumore. Questo effetto è amplificato nel caso in cui le cellule HUVEC esprimono alti livelli di telomerasi. Al contrario, cellule HUVEC in cui, tramite RNAi, è impedita la riattivazione dell’espressione della telomerasi non sopravvivono nemmeno se co-iniettate insieme al GBM. Tramite l’utilizzo della tecnica dell’RNAi siamo andati poi ad inibire il pathway di HIF nelle cellule di GBM umano. In vitro, mediante curve di crescita e saggi di proliferazione, abbiamo dimostrato che il tasso proliferativo delle cellule in cui HIF-1 è inibito non si presenta alterato. Invece in co-coltura, dopo molte replicazioni cellulari, il numero delle cellule wild type è maggiore rispetto alla controparte con l’espressione di HIF-1 inibita. In modelli di tumorigenesi in vivo in topi nudi, mediante iniezione nel sottocute murino, abbiamo poi dimostrato che la tumorigenicità dei due gruppi è comparabile. Al contrario, inaspettatamente, co-iniettando le due popolazioni cellulari si ottenevano tumori misti con caratteristiche di aggressività accresciute, sia in termini di percentuale di attecchimento dello xenotrapianto, sia in termini di dimensioni raggiunte dal tumore. Questo dato suggerisce che l’eterogeneità della popolazione cellulare nella capacità di rispondere all’ipossia può promuovere l’aggressività tumorale.