Immunità innata e tubercolosi: identificazione di ligandi molecolari coinvolti nella risposta antitubercolare e generazione di liposomi contenenti lipidi bioattivi ad attività immunomodulante

Tuberculosis (TB) is a worldwide infection disease, due to a single pathogen infection, which is estimated to kill over 2 million people annually. The causative agent of TB is Mycobacterium tuberculosis (MTB), an intracellular pathogen which infects human host and interferes with host antimicrobial pathways to allow intracellular survival, inhibiting Phospholipase D (PLD) dependent Phosphatidic Acid (PA) generation. The present study shows a novel role of synthetic oligodeoxynucleotides containing unmethylated CpG dinucleotides (CpG ODN), Lysophosphatidic Acid (LPA) and Sphingosine 1-phosphate (S1P) in the activation of antimicrobial immune response by innate immune cells, such as human monocytes/macrophages and type II human alveolar epithelial cells alveolar. In this context, we found that CpG, LPA and S1P stimulation i) induce Ca++-dependent PLD activation, ii) promote PLD-dependent phagolysosome maturation, and iii) enhance a PLD dependent intracellular mycobacterial killing. These results show that alveolar epithelial cells may represent efficient effecter cells of innate antimycobacterial immune response and that PLD activation i) is crucial for the activation of phagolysosome maturation-based antimicrobial response, ii) is conserved among cell types and iii) is at the intersection of different metabolic pathways, independent of the upstream stimulus received. In order to deliver these second lipid messengers able to recover or enhance host antimicrobial innate immune response to infected cells, a technological platform has been developed. In this context, apoptotic body-like liposomes characterized by the presence of phosphatidylserine (PS) in the outer lipid leaflet were engineered to contain PA in the inner lipid surface. We demonstrate that these liposomes can be internalized by macrophages and reduce production of proinfiammatory cytokines (IL-beta, TNF-alpha, IL-12, IL-23) by simultaneously inducing the production of IL-27. Moreover, the stimulation of human macrophages with apoptotic body like liposomes lead to Ca++ mobilization, Ca++-dependent phagolysosome maturation, and phagolysosome maturation dependent intracellular mycobacterial killing. Altogether, these results suggest the possibility to use apoptotic-like vesicles as Trojan particles to deliver second lipid messengers to restore those molecular pathways inhibited by intracellular pathogens as an intracellular survival strategy.

La tubercolosi (TB) è la malattia infettiva, causata da un singolo agente infettivo, più diffusa a livello mondiale ed è responsabile di più di due milioni di decessi ogni anno. L’agente eziologico della tubercolosi è il Mycobacterium tuberculosis (MTB), un patogeno intracellulare aerobio obbligato che infetta l’uomo, preferibilmente per via aereosolica, riuscendo a sopravvivere a livello intracellulare. Un meccanismo d’evasione che MTB attua per sfuggire all’azione micobattericida del macrofago è rappresentato dalla maturazione del fagolisosoma e dall’inibizione dell’enzima fosfolipasi D (PLD), il cui prodotto metabolicamente attivo è l’acido fosfatidico (PA). In questa Tesi abbiamo studiato il ruolo di ligandi d’origine microbica, quali le sequenze CpG, e ligandi naturali, come Acido Lisofosfatidico (LPA) e Sfingosina 1-fosfato (S1P), nella risposta immunitaria innata antimicobatterica in cellule epiteliali alveolari e in cellule della linea monocito/macrofagica. In questo contesto, abbiamo dimostrato che, in entrambi i tipi cellulari, la stimolazione con CpG, LPA o S1P può i) inibire la crescita intracellulare di MTB attraverso l’azione della PLD, ii) indurre l’attivazione della PLD Ca++-dipendente, iii) promuovere la maturazione del fagolisosoma mediate il coinvolgimento della PLD in cellule infettate con MTB. Questi risultati indicano che le cellule epiteliali alveolari, oltre ai monociti-macrofagi, possono svolgere un ruolo attivo nell’ambito della risposta immunitaria innata antitubercolare e che l’attivazione della PLD con la conseguente produzione di PA, è cruciale per l’attivazione della risposta antimicrobica basata sulla maturazione fagolisosomale. Su queste basi, abbiamo ideato liposomi in grado di veicolare secondi messaggeri lipidici, come il PA la cui produzione è soppressa in corso di infezione con MTB, in grado di ristabilire o potenziare la risposta immunitaria innata micobattericida. Abbiamo, quindi, prodotto liposomi asimmetrici simili a corpi apoptotici caratterizzati dalla presenza di fosfatidilserina (PS) sul foglietto lipidico esterno e PA nel foglietto interno. I nostri risultati indicano che tali liposomi possono essere efficacemente internalizzati nei macrofagi senza indurre segnali proinfiammatori. Inoltre, la stimolazione di macrofagi umani con questi liposomi i) induce un incremento dei flussi di Ca++, ii) promuove la maturazione del fagolisosoma Ca++-dipendente e iii) riduce la crescita intracellulare micobatterica in maniera dipendente dalla maturazione fagolisosomale. In conclusione, questi risultati suggeriscono la possibilità di usare i liposomi come “cavalli di Troia” per veicolare secondi messaggeri lipidici e ripristinare quei segnali molecolari frequentemente inibiti dai patogeni intracellulari come strategia di sopravvivenza nella cellula ospite.