Ruolo della chinasi ATM (Atassia Telangiectasica Mutata) nel meccanismo molecolare con cui agenti chemioterapici sensibilizzano linee tumorali all'apoptosi indotta da TRAIL

Ataxia Telangiectasia (A-T) is a rare genetic neurodegenerative disease, caused by the lack of functional ATM kinase, a major actor of the Double Stand Break (DSB) DNA-damage response. A-T is characterized by A-T is characterized by cerebellar degeneration, which leads to severe, progressive neuromotor dysfunction, immunodeficiency, genomic instability and extreme sensitivity to ionizing radiation and DSB-inducing agents. We have recently identified ATM as a novel modulator in the Fas-induced apoptosis. ATM is a negative modulator of the levels of the antiapoptotic c-FLIP protein and promote the cell death. Recently TRAIL, another member of the TNF family has been proposed as a new potential new chemioterapic drug, able to induce apoptosis specifically in tumour cell lines but not show any toxic effects in normal cells. However, since about 60% of tumour cells are resistant to TRAIL induced apoptosis, several combined therapy approaches aimed to sensitize cells to TRAIL have been proposed. Several therapies with DNA damaging agents trigger a molecular mechanism not completely understood. The object of this project is to identify whether the ATM kinase activity plays a role in the ability of chemioterapic induced FLIP downregulation which in turn sensitize cancer cell lines to TRAIL. Using A-T lymphoid cells we could show that ATM deficiency causes resistance to TRAIL induced apoptosis. A-T cells upregulate FLIP protein levels, and this is related to an increased resistance to TRAIL-induced apoptosis. Reconstitution of ATM kinase activity was sufficient to decrease FLIP levels and to restore TRAIL sensitivity. Using hepatocarcinoma cell lines resistant to TRAIL, we found that genetic and pharmacological inhibition of ATM kinase activity impaired FLIP downregulation by chemioterapic drug 5-FU, supporting the hypothesis that ATM kinase activity is required to modulate FLIP protein levels. Furthermore we could show that FLIP levels are specifically modulated by the proteasomal pathway depending on ATM kinase, which act directly on E3 ubiquitin ligase ITCH. We could show also that this mechanism is independent on the p53 state, which is mutated in many tumours. Therefore, this work suggests a molecular mechanism by which 5-FU and other chemioterapic drug that triggers DNA damage, sensitize tumoural cell lines to TRAIL induced apoptosis and propose the utilization of this mechanism in a wide range of tumours, because of its independence of the state of p53, but on condition that the kinase activity of ATM is not compromised. Therefore we propose that the activity of ATM kinase plays a crucial role in the setting of combined therapies based on TRAIL sensitization through DNA damaging agents. Furthermore we propose a molecular mechanism in which ATM might regulate the protein stability, involving the ubiquitin proteasome pathway, whose alteration may be critical in the AT pathology development.

L’Atassia-Telangectasica (AT) è una patologia neurodegenerativa autosomica, associata alla mutazione su entrambi gli alleli del gene che codifica per la chinasi ATM. L’AT è caratterizzata da una marcata perdita delle cellule del Purkinje e dei granuli, che porta all’atassia, dalla sensibilizzazione alle radiazioni ionizzanti e dall’alta incidenza dello sviluppo di tumori, principalmente a carico dell’apparato immunitario. Abbiamo recentemente identificato ATM come un modulatore importante dell’apoptosi mediata da Fas, un membro della famiglia dei TNF receptors. ATM modula negativamente i livelli della proteina antiapoptotica FLIP, favorendo la morte cellulare. Recentemente TRAIL, un altro membro della famiglia del TNF, è stato proposto come un nuovo potenziale chemioterapico in grado di indurre apoptosi principalmente nelle cellule tumorali senza mostrare significativa tossicità nelle cellule normali. Molte linee tumorali sono però resistenti a TRAIL ed il cotrattamento con chemioterapici che inducono danno al DNA attiva un meccanismo molecolare ancora poco chiaro. L’obiettivo di questo progetto è stato quindi quello di verificare l’ipotesi che ATM possa essere alla base di un meccanismo molecolare attraverso cui le rotture a doppia elica del DNA sono in grado di ridurre i livelli della proteina antiapoptotica c-FLIP ed incrementare la sensibilità cellulare alla morte apoptotica indotta dalla stimolazione del recettore per TRAIL. Abbiamo verificato quindi che cellule linfoblastoidi prive di ATM funzionale sono sensibilmente resistenti alla morte indotta dal recettore TRAIL. Tale resistenza all’apoptosi correla con alti livelli di espressione nelle cellule di FLIP. La ricostituzione di queste cellule con una forma cataliticamente attiva di ATM è sufficiente per abbassare i livelli di FLIP e ripristinare la sensibilità all’apoptosi indotta da TRAIL. Utilizzando un modello sperimentale di epatocarcinoma resistente a TRAIL abbiamo dimostrato, mediante inibizione di farmacologia o genetica di ATM, che l’attività chinasica di ATM è assolutamente necessaria per la sensibilizzazione di tali cellule a TRAIL mediata dall’agente chemioterapico 5-FU. Inoltre in questo sistema ATM media la degradazione di FLIP attraverso la via del proteasoma, in modo p53 indipendente ed agendo direttamente sull’ubiquitina ligasi ITCH. Questo lavoro suggerisce quindi un meccanismo molecolare con cui il 5-FU ed altri chemioterapici, che provocano danno al DNA, sensibilizzano linee tumorali a TRAIL e propone che tale meccanismo possa essere utilizzato in un ampio spettro di tumori, in quanto indipendente dallo stato di p53, purché in tali tumori non sia compromessa la funzionalità di ATM L'attività chinasica di ATM sembra quindi un prerequisito importante nella messa a punto di terapie combinate basate sulla sensibilizzazione alla morte da recettore, selettivamente sulle cellule tumorali, attraverso agenti che danneggiano il DNA. Inoltre viene proposto un meccanismo molecolare in cui ATM sembra essere implicato nella regolazione della stabilità proteica, agendo sulla via dell’ubiquitina proteasoma, la cui alterazione potrebbe avere un ruolo ancora da chiarire nello sviluppo dell’AT.