Analisi genetica e meccanismi molecolari alla base di patologie rare dell'epidermide

The disorders of keratinisation are also defined “genodermatosis” because of their genetic basis, and they are characterized by very different, and often overlapping, clinical and histopathological features that affect skin. For these reasons and because of their rarity, their classification is very complex. For some of these diseases, the molecular mechanism can be identified as mutations of a single gene, but for others it involves several factors. Generally these disfiguring diseases are rarely fatal, and have different degrees of severity. The morphological changes of keratinocytes occurred during their differentiation are determined by biochemical changes as result of programmed activation and inhibition of several specific differentiation proteins. Any skin defects in its structural components (fat proteins or enzymes responsible for their synthesis), in its processing or assembly, can destroy the skin barrier or alter turnover process, resulting in a variety of pathological conditions. The study of factors involved in developing skin is indispensable for a deeper understanding of genodermatosis onset. The object of this work consists of three different skin diseases, associated with three different genes but with some common phenotypic characteristics. We analyzed 60 Italians patients affected by lamellar ichthyosis, a congenital autosomal dominant disorder of keratinization, in order to analyze and summarize common mutation in our country. We used a specific approach for the molecular analysis of TGM1 gene, which encodes the transglutaminase 1 (TGasi1), known as one of the responsible genes for disease onset. The method which we developed in this work can be considered an approach for prenatal diagnosis of specific TGasi1-dependent lamellar ichthyosis. We also analyzed Sjogren-Larsson syndrome (SLS), another form of ichthyosis caused by ALDH3A2 mutations, which codes for the FALDH enzyme, a crucial protein for the fatty acids metabolism. This study aims to clarify the molecular mechanism responsible for the onset of this disease in Italy, in order to use our knowledge for a more complete and effective diagnosis. In this work we show two separate cases, one caused by a new mutation not yet described in literature. The third pathology analyzed in this work has an ichthyotic phenotype and other phenotypic characteristics associated with epidermal differentiation. This disease, named KID syndrome (Keratitis-Ichtyosis-Deafness), is caused by mutations in the GJB2 gene, coding for the connexin 26. This protein is necessary for gap junction assembly. In this study were found two different mutations in two patients, one of these never described in literature. We analyzed the mutant proteins arising from these two mutations in order to highlight possible differences in the functional mechanisms causing the onset of the disease. Using cytofluorometric and electrophysiological approaches, we could also clarify the involvement of the mutant proteins in intracellular calcium flow regulation and their involvement in the induction of cell death through necrosis.

Le genodermatosi o "disordini della cheratinizzazione", sono così definite perche' hanno come base dei difetti genetici, che hanno come conseguenze caratteristiche cliniche ed istopatologiche molto variabili e spesso sovrapponibili. Per questi motivi e a causa della loro rarità, la loro classificazione è molto complessa. In alcune patologie dermatologiche il meccanismo molecolare alla base della malattia può essere identificato nell'alterazione di un singolo gene, mentre in altri casi sono coinvolti numerosi fattori. In generale, si tratta di malattie deturpanti ma raramente letali che si presentano con gradi di severità variabile. I cambiamenti morfologici dei cheratinociti, durante il loro differenziamento, sono determinati da modificazioni biochimiche che riflettono un programma d’attivazione ed inibizione sequenziale a carico di vari prodotti genici specifici per il differenziamento. Qualsiasi difetto nei suoi componenti strutturali, sia proteici che lipidici, o negli enzimi responsabili della loro sintesi, del loro processamento e assemblaggio, possono distruggere la barriera epidermica o alterarne il processo di turnover dando luogo ad una varietà di stati morbosi. Lo studio dei diversi fattori che intervengono nello sviluppo epidermico è necessario ai fini di una maggiore comprensione delle cause dell’insorgere delle genodermatosi. In questa tesi sono state affrontate tre diverse patologie epidermiche, associate a tre diversi geni, che possiedono però alcune caratteristiche fenotipiche comuni. Sono stati analizzati 60 pazienti italiani diagnosticati per l’ittiosi lamellare, un disturbo congenito della cheratinizzazione che si trasmette in maniera autosomica dominante, al fine di avere un quadro più ampio sulle mutazioni ricorrenti nella nostra popolazione. Abbiamo utilizzato un approccio specifico per l’analisi molecolare del gene TGM1, che codifica per la transglutaminasi 1 (TGasi1), noto per essere uno dei geni responsabili dell’insorgere della patologia. La metodica messa a punto in questo lavoro può essere considerata un approccio alla diagnosi prenatale specifica per l’ittiosi lamellare TGasi1 dipendente. È stato inoltre affrontato lo studio di una diversa forma di ittiosi, la sindrome di Sjogren-Larsson (SLS) causata da mutazioni del gene ALDH3A2 che codifica per l’enzima FALDH, fondamentale per il metabolismo degli acidi grassi. L’obiettivo di questo studio è stato il chiarimento delle dinamiche molecolari responsabili dell’insorgere di questa patologia nella popolazione italiana al fine di utilizzare le nostre conoscenze per una diagnosi più completa ed efficace. In questo lavoro presentiamo due casi distinti di cui uno causato dalla presenza di una mutazione fino ad oggi non ancora descritta in letteratura. La terza patologia oggetto di questo lavoro di tesi, presenta un fenotipo ittiosico ed altre caratteristiche fenotipiche legate al differenziamento epidermico. La KID sindrome (Keratitis-Ichtyosis-Deafness) è causata da mutazioni del gene GJB2 che codifica per la connessina 26, una proteina necessaria per l’assemblaggio delle giunzioni comunicanti (gap junction). Nei due pazienti analizzati in questo studio sono state riscontrate due diverse mutazioni, di cui una mai descritta in letteratura, e sono state caratterizzate le due proteine mutanti al fine di evidenziare eventuali differenze funzionali, responsabili dei meccanismi che provocano l’insorgere di questa patologia. Utilizzando diversi approcci, uno citofluorimetrico, l’altro elettrofisiologico, abbiamo potuto inoltre evidenziare il coinvolgimento delle due proteine mutanti nella regolazione del flusso di calcio intracellulare e nel loro coinvolgimento nell’induzione di morte cellulare attraverso meccanismi di necrosi.