Due to their ability to transduce non-dividing cells and stably integrate, lentiviral vectors (LV) are a candidate system for therapeutic gene transfer in a number of genetic diseases. However, the use of LV may be hampered by their ability to trigger innate and adaptive immunity. Immune responses against genetically modified cells represent a major obstacle to the success of gene therapy. Cellular and humoral immune responses to vector associated and transgene-derived proteins lead to prompt elimination of transgene expressing cells abrogating, the benefits of gene transfer. A non-therapeutic murine model of gene therapy has been established. LV, encoding for green fluorescent protein (GFP) under the control of an ubiquitous promoter, was intravenously administrated into immunocompetent mice in order to define the kinetics of transgene expression, characterize the anti-transgene immune response and develop different approaches to overcome the anti-transgene immunity and achieve long term transgene expression. Several strategies have been used to limit immune response following gene transfer, including immunosuppression, and the use of less immunogenic routes of administration. In the present work we focused our attention in inducing immunological tolerance to transgene expressing cells as first approach, by a cellular therapy, and second, through the use micro-RNA (mir) regulated lentiviral vectors. Regulatory T cells (Tregs), which have been demonstrated to control immune responses in vivo, were tested for their ability to suppress anti-transgene response leading to stable long-term gene expression. Adoptive transfer of naturally occurring CD4+CD25+ Tregs (nTregs) isolated from wt mice or from transgene tolerant transgenic (tg) mice did not suppress the anti-transgene immune response after LV delivery. These data demonstrate that neither increasing the endogenous pool of nTregs nor transferring nTregs selected in a transgene expressing thymus can modulate the immune response and mediate sustained transgene expression. Conversely, adoptive transfer of antigen presenting cells (APC) isolated from transgene tolerant tg mice efficiently reduced the immune response leading to stable LV-encoded protein expression in vivo. Most of the immunogenicity of the LV-based gene transfer protocols depends on the transduction and transgene expression by professional APC that prime T cells inducing an anti-transgene immune response. The use of tissue specific promoters, such as the albumin promoter, has been explored in order to target transgene expression in hepatocytes and drastically reduce transgene expression in APC. Recently, in the same direction, Brown et al. (Nat. Med. 2006; 12:585-591) demonstrated that addition of target sequences for an hematopoietic-specific micro-RNA, mir-142-3p, into LV encoding for GFP under transcriptional control of the ubiquitous PGK promoter (LV.PGK.GFP.142-3pT) prevented transgene expression in all hematopoietic lineages and led to stable transgene expression in the liver. Here, we set out to elucidate the immunological events that enabled stable gene transfer with this microRNA-regulated LV. Results demonstrate that systemic gene transfer by the mir-142-regulated LV can provide robust tolerance to a specific antigen which is mediated by CD4+ Tregs. These findings will have important implications for developing future gene therapy strategies.

I vettori lentivirali (LV) rappresentano una concreta realtà per lo sviluppo di protocolli di terapia genica. I LV, infatti, hanno la capacità di trasdurre ed integrare stabilmente il proprio genoma anche in cellule che non sono in attivo stato di replicazione. Tuttavia, uno dei maggiori ostacoli al successo degli approcci di terapia genica che prevedono l’utilizzo di vettori virali è rappresentato dalla risposta immune innata ed adattativa da essi indotta. Le risposte immuni cellulo-mediate ed anticorpali dirette verso antigeni associati alle particelle virali e alla proteina derivante dal transgene eliminano le cellule geneticamente modificate, rendendo inefficacie la terapia genica. Nello studio qui descritto, abbiamo sviluppato un modello murino di terapia genica, che prevede somministrazione sistemica in topi immunocompetenti di LV codificante per una proteina fluorescente. Tale modello sperimentale è funzionale alla caratterizzazione della cinetica d’espressione del transgene e della risposta immunitaria contro di esso e allo stesso tempo è utile per lo sviluppo di nuovi approcci per la modulazione di tale risposta. Diverse strategie sono state esplorate per la modulazione della risposta al transgene, come l’immunosoppressione e l’utilizzo di vie di somministrazione meno immunogeniche. In questo studio abbiamo indagato la possibilità di ristabilire la tolleranza immunologica nei confronti del prodotto di terapia genica attraverso due differenti modalità: una terapia cellulare da associare al trasferimento genico o l’utilizzo di LV con una regolazione d’espressione dipendente da micro-RNA endogeni. E’ stato ampiamente dimostrato che le cellule CD4+CD25+ T regolatorie (Tregs) rappresentano una sottopopolazione linfocitaria con la capacità di controllare le risposte immunitarie in vivo garantendo la tolleranza agli antigeni “self”. Con l’ausilio del nostro modello animale abbiamo testato se dette cellule fossero in grado di sopprimere la risposta al transgene. Abbiamo così definito che il trasferimento di Tregs, derivanti da topi wild type (wt) o da topi GFP-transgenici (GFP-tg), tolleranti per GFP, non è in grado di controllare la risposta al transgene. Contrariamente, il trasferimento di un’ alta dose di cellule presentanti l’antigene (APC), derivate da topi GFP-tg, sono risultate efficaci nel controllo della risposta immune estendendo significativamente i tempi di espressione del transgene. La risposta immune verso il transgene si genera poiché, dopo la somministrazione del vettore lentivirale, una frazione delle APC esprime il transgene e ne presenta epitopi con modalità immunogenica attivando le cellule T. Promotori tessuto-specifici, come quello per l’albumina, sono stati testati per ridurre l’espressione del transgene nelle APC, restringendola ai soli epatociti. Recentemente, Brown et al. (Nat. Med. 2006; 12:585-591) hanno dimostrato che inserendo ripetute sequenze riconosciute da un micro-RNA, specifico della linea ematopoietica, mir142-3p, nel vettore codificante per GFP (LV.PGK.GFP.mir142-3pT) l’espressione del transgene era abrogata in tutte le cellule di derivazione ematopoietica ma era stabile e persistente nel fegato sia negli epatociti che nelle cellule endoteliali (LSEC). Così, abbiamo studiato come il sistema immunitario reagisce alla somministrazione di tale LV micro-RNA regolato. I dati ottenuti indicano che si genera uno stato di tolleranza verso il transgene, mediata da cellule Tregs. Questi risultati nel loro insieme potranno avere importanti sviluppi per le future applicazioni di protocolli di terapia genica.

Annoni, A. (2009). Strategies for tolerance induction to gene therapy derived products.

Strategies for tolerance induction to gene therapy derived products

ANNONI, ANDREA
2009-01-15

Abstract

I vettori lentivirali (LV) rappresentano una concreta realtà per lo sviluppo di protocolli di terapia genica. I LV, infatti, hanno la capacità di trasdurre ed integrare stabilmente il proprio genoma anche in cellule che non sono in attivo stato di replicazione. Tuttavia, uno dei maggiori ostacoli al successo degli approcci di terapia genica che prevedono l’utilizzo di vettori virali è rappresentato dalla risposta immune innata ed adattativa da essi indotta. Le risposte immuni cellulo-mediate ed anticorpali dirette verso antigeni associati alle particelle virali e alla proteina derivante dal transgene eliminano le cellule geneticamente modificate, rendendo inefficacie la terapia genica. Nello studio qui descritto, abbiamo sviluppato un modello murino di terapia genica, che prevede somministrazione sistemica in topi immunocompetenti di LV codificante per una proteina fluorescente. Tale modello sperimentale è funzionale alla caratterizzazione della cinetica d’espressione del transgene e della risposta immunitaria contro di esso e allo stesso tempo è utile per lo sviluppo di nuovi approcci per la modulazione di tale risposta. Diverse strategie sono state esplorate per la modulazione della risposta al transgene, come l’immunosoppressione e l’utilizzo di vie di somministrazione meno immunogeniche. In questo studio abbiamo indagato la possibilità di ristabilire la tolleranza immunologica nei confronti del prodotto di terapia genica attraverso due differenti modalità: una terapia cellulare da associare al trasferimento genico o l’utilizzo di LV con una regolazione d’espressione dipendente da micro-RNA endogeni. E’ stato ampiamente dimostrato che le cellule CD4+CD25+ T regolatorie (Tregs) rappresentano una sottopopolazione linfocitaria con la capacità di controllare le risposte immunitarie in vivo garantendo la tolleranza agli antigeni “self”. Con l’ausilio del nostro modello animale abbiamo testato se dette cellule fossero in grado di sopprimere la risposta al transgene. Abbiamo così definito che il trasferimento di Tregs, derivanti da topi wild type (wt) o da topi GFP-transgenici (GFP-tg), tolleranti per GFP, non è in grado di controllare la risposta al transgene. Contrariamente, il trasferimento di un’ alta dose di cellule presentanti l’antigene (APC), derivate da topi GFP-tg, sono risultate efficaci nel controllo della risposta immune estendendo significativamente i tempi di espressione del transgene. La risposta immune verso il transgene si genera poiché, dopo la somministrazione del vettore lentivirale, una frazione delle APC esprime il transgene e ne presenta epitopi con modalità immunogenica attivando le cellule T. Promotori tessuto-specifici, come quello per l’albumina, sono stati testati per ridurre l’espressione del transgene nelle APC, restringendola ai soli epatociti. Recentemente, Brown et al. (Nat. Med. 2006; 12:585-591) hanno dimostrato che inserendo ripetute sequenze riconosciute da un micro-RNA, specifico della linea ematopoietica, mir142-3p, nel vettore codificante per GFP (LV.PGK.GFP.mir142-3pT) l’espressione del transgene era abrogata in tutte le cellule di derivazione ematopoietica ma era stabile e persistente nel fegato sia negli epatociti che nelle cellule endoteliali (LSEC). Così, abbiamo studiato come il sistema immunitario reagisce alla somministrazione di tale LV micro-RNA regolato. I dati ottenuti indicano che si genera uno stato di tolleranza verso il transgene, mediata da cellule Tregs. Questi risultati nel loro insieme potranno avere importanti sviluppi per le future applicazioni di protocolli di terapia genica.
A.A. 2007/2008
Pediatria molecolare e immunologia
20.
Due to their ability to transduce non-dividing cells and stably integrate, lentiviral vectors (LV) are a candidate system for therapeutic gene transfer in a number of genetic diseases. However, the use of LV may be hampered by their ability to trigger innate and adaptive immunity. Immune responses against genetically modified cells represent a major obstacle to the success of gene therapy. Cellular and humoral immune responses to vector associated and transgene-derived proteins lead to prompt elimination of transgene expressing cells abrogating, the benefits of gene transfer. A non-therapeutic murine model of gene therapy has been established. LV, encoding for green fluorescent protein (GFP) under the control of an ubiquitous promoter, was intravenously administrated into immunocompetent mice in order to define the kinetics of transgene expression, characterize the anti-transgene immune response and develop different approaches to overcome the anti-transgene immunity and achieve long term transgene expression. Several strategies have been used to limit immune response following gene transfer, including immunosuppression, and the use of less immunogenic routes of administration. In the present work we focused our attention in inducing immunological tolerance to transgene expressing cells as first approach, by a cellular therapy, and second, through the use micro-RNA (mir) regulated lentiviral vectors. Regulatory T cells (Tregs), which have been demonstrated to control immune responses in vivo, were tested for their ability to suppress anti-transgene response leading to stable long-term gene expression. Adoptive transfer of naturally occurring CD4+CD25+ Tregs (nTregs) isolated from wt mice or from transgene tolerant transgenic (tg) mice did not suppress the anti-transgene immune response after LV delivery. These data demonstrate that neither increasing the endogenous pool of nTregs nor transferring nTregs selected in a transgene expressing thymus can modulate the immune response and mediate sustained transgene expression. Conversely, adoptive transfer of antigen presenting cells (APC) isolated from transgene tolerant tg mice efficiently reduced the immune response leading to stable LV-encoded protein expression in vivo. Most of the immunogenicity of the LV-based gene transfer protocols depends on the transduction and transgene expression by professional APC that prime T cells inducing an anti-transgene immune response. The use of tissue specific promoters, such as the albumin promoter, has been explored in order to target transgene expression in hepatocytes and drastically reduce transgene expression in APC. Recently, in the same direction, Brown et al. (Nat. Med. 2006; 12:585-591) demonstrated that addition of target sequences for an hematopoietic-specific micro-RNA, mir-142-3p, into LV encoding for GFP under transcriptional control of the ubiquitous PGK promoter (LV.PGK.GFP.142-3pT) prevented transgene expression in all hematopoietic lineages and led to stable transgene expression in the liver. Here, we set out to elucidate the immunological events that enabled stable gene transfer with this microRNA-regulated LV. Results demonstrate that systemic gene transfer by the mir-142-regulated LV can provide robust tolerance to a specific antigen which is mediated by CD4+ Tregs. These findings will have important implications for developing future gene therapy strategies.
gene transfer; transgene expression; lentiviral vector; tolerance; regulatory T cells; micro-RNA
Settore MED/38 - Pediatria Generale e Specialistica
English
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Tesi di dottorato
Annoni, A. (2009). Strategies for tolerance induction to gene therapy derived products.
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