TOP mRNAs encode for ribosomal proteins, elongation factors and several other proteins associated with the assembly or function of the translational apparatus. These messengers are identified by two major characteristics : i) a 5’ terminal oligopyrimidine tract (TOP motif), ii) a growth- dependent translational regulation. It has been shown both in vitro (cultured cells) and in vivo that perturbation of cellular growth, due to a variety of causes (development, mitogens, drugs etc.), is correlated to specific, rapid and reversible changes in TOP mRNAs polysomal association. It has been found that the 5’-UTR of these mRNAs, including the TOP sequence, is the cis- acting element responsible for regulation but the trans-acting factors and pathways involved remain incompletely understood. Several studies reported that La may play a role in TOP mRNA translational regulation, but its precise function in this process remains to be determined. La is an evolutionary conserved and abundant RNA-binding phosphoprotein, present mostly in the nucleus, where is associated with the 3’ poly(U)-rich elements of nascent RNA polymerase III (pol III) transcripts. A major role of La protein is to protect newly synthesized small RNAs from exonuclease digestion, ensuring that they are correctly folded and processed. However, despite the mainly nuclear localization, cytoplasmic functions connected with translation have been ascribed to La. The best documented and most studied role in the cytoplasm is in the translational initiation of certain viral RNAs. About the role of La in TOP mRNAs regulation some reports describe a positive effect on TOP mRNA translation, while other authors define an inhibitory effect of this protein. For this reason, we have constructed and analyzed human cell lines that overexpress wild type La or mutated La lacking the nuclear localization signal (NLS). Our results indicate that, both in serum deprivated cells and growing cells, overexpression of La does not alter significantly the association of TOP mRNAs with polysomes. As an experimental approach alternative to overexpression we utilized RNA interference to induce a decrease of La protein. About 70% reduction in La protein level does not cause visible consequences on TOP translation. It’s known that La is part of the cytoplasmic Ro ribonucleoprotein (RNP) complex, which also includes Ro60 and Y RNA , and it is reported that Ro60 is required for the binding of La to the TOP element. Therefore we decided to investigate the possible involvement of the Ro RNP complex in TOP mRNA translation. The RNP complexes are small cytoplasmic particles of unknown functions that are well conserved during evolution and are expressed in all types of cells. We performed sedimentation analysis of cytoplasmic extracts fractionated on sucrose gradients or pelletted by centrifugation, and we found that La, Ro 60 and Y RNA cosediment on polysomes with TOP mRNAs in different growth conditions. As the binding of La to the TOP sequence has been demonstrated by several independent groups, it can be hypothesized that La recruits the Ro complex on TOP mRNA. Although this has to be proven, we have shown that a decrease of La protein abolishes the Ro60 and Y1 RNA cosedimentation with polysomes. Taken together, our data are consistent with a possible role of Ro RNP complex in TOP mRNAs translational regulation.

I TOP mRNA codificano per le proteine ribosomali, fattori di allungamento e diverse altre proteine coinvolte con l’assemblaggio o la funzione dell’apparato di traduzione. Questi messaggeri sono identificati da due caratteristiche principali: i) un tratto di oligopirimidine nel 5’ UTR ( il motivo TOP), ii) una regolazione traduzionale dipendente dalle condizioni di crescita. E’ stato riportato sia in vitro ( cellule in coltura) che in vivo che la perturbazione delle condizioni di crescita cellulare, causata da una variètà di cause ( sviluppo, mitogeni, uso di droghe etc.), è correlata ad uno specifico, rapido e reversibile cambiamento dell’associazione polisomale dei messaggeri TOP. E’ stato dimostrato che il 5’UTR di questi messaggeri, comprensivo della sequenza TOP, è l’elemento che agisce in cis responsabile per la regolazione, ma i fattori in trans ed i pathways coinvolti non sono ancora stati chiariti. E’ stato mostrato che la proteina La lega il motivo TOP nel 5’ UTR ma il significato funzionale di questa interazione è ancora ambiguo. La è una abbondante proteina che lega l’RNA, evolutivamente conservata. Ha una localizzazione prevalentemente nucleare ed è associata con gli elementi ricchi in uridine del 3’ UTR dei trascritti appena sintetizzati dalla RNA polimerasi III (Pol III). Il principale ruolo di La è proteggere da digestione esonucleasica i piccoli RNA neosintetizzati, assicurando che possano essere ripiegati e processati correttamente. Comunque, nonostante la prevalente localizzazione nucleare, sono state riportate funzioni citoplasmatiche della proteina La connesse con la traduzione. Il ruolo più documentato e meglio studiato della proteina La nel citoplasma è il suo coinvolgimento nell’inizio traduzionale di alcuni RNA virali. Alcuni studi suggeriscono che la proteina La può avere un ruolo positivo nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP mentre altri risultati indicano un ruolo negativo di La sulla traduzione deimessaggeri TOP. Evidentemente la proteina La interagisce con i messaggeri TOP ed è in qualche modo coinvolta nella loro regolazione traduzionale, ma il suo ruolo preciso in questo processo rimane da essere determinato. Per questo motivo abbiamo costruito ed analizzato linee cellulari umane che sovraesprimessero la proteina La “wild- type” od una forma mutata, mancante della sequenza di localizzazione nucleare (NLS). I nostri risultati indicano che, sia in cellule quiescenti sia in attiva crescita, la sovraespressione di La non altera in maniera significativa l’associazione polisomale dei messaggeri TOP. Come approccio sperimentale alternativo alla sovraespressione abbiamo utilizzato l’RNA interference per indurre un decremento della proteina La. abbiamo ottenuto oltre il 70% di riduzione nel livello proteico della proteina La ma questa diminuzione non causa conseguenze visibili sulla traduzione dei messaggeri TOP. I risultati degli esperimenti di sovraespressione e di interference di La ci hanno indotto ad analizzare il coinvolgimento di altri possibili effettori nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP. In particolare ci siamo concentrati sulla proteina Ro60, indicata in letteratura come fattore richiesto per il legame di La alla sequenza TOP. Abbiamo compiuto esperimenti di cosedimentazione ed abbiamo trovato, sia frazionando estratti citoplasmatici su gradiente di saccarosio sia separandoli per centrifugazione, che Ro60, La e Y1 colocalizzano con i polisomi in differenti condizioni di crescita. Ciò indica una possibile connessione funzionale tra il complesso Ro60 e la regolazione traduzionale dei messaggeri TOP. Poichè il legame di La alla sequenza TOP è stato provato da diversi gruppi indipendenti, si può ipotizzare che La recluti il complesso di Ro sui messaggeri TOP; anche se questa ipotesi deve essere provata, noi abbiamo dimostrato che Ro60 e Y1 non cosedimentano con i polisomi quando è indotto un decremento della proteina La. Complessivamente i nostri dati sono in accordo con un possibile ruolo del complesso Ro RNP nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP.

De Stefano, M.C. (2009). Relazione tra la proteina La e la regolazione traduzionale dei messaggeri TOP.

Relazione tra la proteina La e la regolazione traduzionale dei messaggeri TOP

DE STEFANO, MARIA CHIARA
2009-01-13

Abstract

TOP mRNAs encode for ribosomal proteins, elongation factors and several other proteins associated with the assembly or function of the translational apparatus. These messengers are identified by two major characteristics : i) a 5’ terminal oligopyrimidine tract (TOP motif), ii) a growth- dependent translational regulation. It has been shown both in vitro (cultured cells) and in vivo that perturbation of cellular growth, due to a variety of causes (development, mitogens, drugs etc.), is correlated to specific, rapid and reversible changes in TOP mRNAs polysomal association. It has been found that the 5’-UTR of these mRNAs, including the TOP sequence, is the cis- acting element responsible for regulation but the trans-acting factors and pathways involved remain incompletely understood. Several studies reported that La may play a role in TOP mRNA translational regulation, but its precise function in this process remains to be determined. La is an evolutionary conserved and abundant RNA-binding phosphoprotein, present mostly in the nucleus, where is associated with the 3’ poly(U)-rich elements of nascent RNA polymerase III (pol III) transcripts. A major role of La protein is to protect newly synthesized small RNAs from exonuclease digestion, ensuring that they are correctly folded and processed. However, despite the mainly nuclear localization, cytoplasmic functions connected with translation have been ascribed to La. The best documented and most studied role in the cytoplasm is in the translational initiation of certain viral RNAs. About the role of La in TOP mRNAs regulation some reports describe a positive effect on TOP mRNA translation, while other authors define an inhibitory effect of this protein. For this reason, we have constructed and analyzed human cell lines that overexpress wild type La or mutated La lacking the nuclear localization signal (NLS). Our results indicate that, both in serum deprivated cells and growing cells, overexpression of La does not alter significantly the association of TOP mRNAs with polysomes. As an experimental approach alternative to overexpression we utilized RNA interference to induce a decrease of La protein. About 70% reduction in La protein level does not cause visible consequences on TOP translation. It’s known that La is part of the cytoplasmic Ro ribonucleoprotein (RNP) complex, which also includes Ro60 and Y RNA , and it is reported that Ro60 is required for the binding of La to the TOP element. Therefore we decided to investigate the possible involvement of the Ro RNP complex in TOP mRNA translation. The RNP complexes are small cytoplasmic particles of unknown functions that are well conserved during evolution and are expressed in all types of cells. We performed sedimentation analysis of cytoplasmic extracts fractionated on sucrose gradients or pelletted by centrifugation, and we found that La, Ro 60 and Y RNA cosediment on polysomes with TOP mRNAs in different growth conditions. As the binding of La to the TOP sequence has been demonstrated by several independent groups, it can be hypothesized that La recruits the Ro complex on TOP mRNA. Although this has to be proven, we have shown that a decrease of La protein abolishes the Ro60 and Y1 RNA cosedimentation with polysomes. Taken together, our data are consistent with a possible role of Ro RNP complex in TOP mRNAs translational regulation.
13-gen-2009
A.A. 2007/2008
Biologia molecolare e cellulare
20.
I TOP mRNA codificano per le proteine ribosomali, fattori di allungamento e diverse altre proteine coinvolte con l’assemblaggio o la funzione dell’apparato di traduzione. Questi messaggeri sono identificati da due caratteristiche principali: i) un tratto di oligopirimidine nel 5’ UTR ( il motivo TOP), ii) una regolazione traduzionale dipendente dalle condizioni di crescita. E’ stato riportato sia in vitro ( cellule in coltura) che in vivo che la perturbazione delle condizioni di crescita cellulare, causata da una variètà di cause ( sviluppo, mitogeni, uso di droghe etc.), è correlata ad uno specifico, rapido e reversibile cambiamento dell’associazione polisomale dei messaggeri TOP. E’ stato dimostrato che il 5’UTR di questi messaggeri, comprensivo della sequenza TOP, è l’elemento che agisce in cis responsabile per la regolazione, ma i fattori in trans ed i pathways coinvolti non sono ancora stati chiariti. E’ stato mostrato che la proteina La lega il motivo TOP nel 5’ UTR ma il significato funzionale di questa interazione è ancora ambiguo. La è una abbondante proteina che lega l’RNA, evolutivamente conservata. Ha una localizzazione prevalentemente nucleare ed è associata con gli elementi ricchi in uridine del 3’ UTR dei trascritti appena sintetizzati dalla RNA polimerasi III (Pol III). Il principale ruolo di La è proteggere da digestione esonucleasica i piccoli RNA neosintetizzati, assicurando che possano essere ripiegati e processati correttamente. Comunque, nonostante la prevalente localizzazione nucleare, sono state riportate funzioni citoplasmatiche della proteina La connesse con la traduzione. Il ruolo più documentato e meglio studiato della proteina La nel citoplasma è il suo coinvolgimento nell’inizio traduzionale di alcuni RNA virali. Alcuni studi suggeriscono che la proteina La può avere un ruolo positivo nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP mentre altri risultati indicano un ruolo negativo di La sulla traduzione deimessaggeri TOP. Evidentemente la proteina La interagisce con i messaggeri TOP ed è in qualche modo coinvolta nella loro regolazione traduzionale, ma il suo ruolo preciso in questo processo rimane da essere determinato. Per questo motivo abbiamo costruito ed analizzato linee cellulari umane che sovraesprimessero la proteina La “wild- type” od una forma mutata, mancante della sequenza di localizzazione nucleare (NLS). I nostri risultati indicano che, sia in cellule quiescenti sia in attiva crescita, la sovraespressione di La non altera in maniera significativa l’associazione polisomale dei messaggeri TOP. Come approccio sperimentale alternativo alla sovraespressione abbiamo utilizzato l’RNA interference per indurre un decremento della proteina La. abbiamo ottenuto oltre il 70% di riduzione nel livello proteico della proteina La ma questa diminuzione non causa conseguenze visibili sulla traduzione dei messaggeri TOP. I risultati degli esperimenti di sovraespressione e di interference di La ci hanno indotto ad analizzare il coinvolgimento di altri possibili effettori nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP. In particolare ci siamo concentrati sulla proteina Ro60, indicata in letteratura come fattore richiesto per il legame di La alla sequenza TOP. Abbiamo compiuto esperimenti di cosedimentazione ed abbiamo trovato, sia frazionando estratti citoplasmatici su gradiente di saccarosio sia separandoli per centrifugazione, che Ro60, La e Y1 colocalizzano con i polisomi in differenti condizioni di crescita. Ciò indica una possibile connessione funzionale tra il complesso Ro60 e la regolazione traduzionale dei messaggeri TOP. Poichè il legame di La alla sequenza TOP è stato provato da diversi gruppi indipendenti, si può ipotizzare che La recluti il complesso di Ro sui messaggeri TOP; anche se questa ipotesi deve essere provata, noi abbiamo dimostrato che Ro60 e Y1 non cosedimentano con i polisomi quando è indotto un decremento della proteina La. Complessivamente i nostri dati sono in accordo con un possibile ruolo del complesso Ro RNP nella regolazione traduzionale dei messaggeri TOP.
proteina La; messaggeri TOP; regolazione traduzionale; gradienti polisomali
Settore BIO/11 - BIOLOGIA MOLECOLARE
Italian
Tesi di dottorato
De Stefano, M.C. (2009). Relazione tra la proteina La e la regolazione traduzionale dei messaggeri TOP.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
ultima e finale corretta tesi.pdf

accesso aperto

Descrizione: Thesis
Dimensione 1.34 MB
Formato Adobe PDF
1.34 MB Adobe PDF Visualizza/Apri

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/2108/748
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact