Studio dell'espressione dei geni del metabolismo degli androgeni e caratterizzazione del profilo citogenetico per la ricerca di biomarcatori genomici in linee primarie di carcinoma della prostata

The aims of this study where to investigate expression profiles of genes related to androgen signaling and to screen genomic alterations in primary epithelial cultures derived from tissue explanted from patients undergoing radical prostatectomy to better understanding the rule of androgen pathway and of genomic copy number changes in the development and progression of prostate cancer. Moreover, we investigated expression profiles of selected genes (NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2) in circulating blood cells of prostate cancer patients to discover new biomarkers for diagnostic purposes. To carry out these aims we developed a low density home made oligonucleotide-array composed of 205 genes selected on the basis of their proved or potential role in prostate cancerogenesis related to androgen signalling (“AndroChip”), and we carried out array-based comparative genomic hibridization (aCGH) on primary epithelial cultures derived from tissue explanted from patients undergoing radical prostatectomy. After microarray experiments, considering only genes resulted significant in all primary cancer cell lines and whose differential expression had a threeshold>±1,5, we identified a total of 15 genes. In summary, we observed differential expression of genes (BCL2, CALR e VIM) able to confer androgen- independent growth and down regulation of PKC-beta gene that may be down-regulated at an early stage in the pathogenesis of prostate cancer. Moreover, we found over expression of NQO1 gene. High levels of NQO1 gene expression have been observed in many cancers as compared to normal tissues of the same origin. NQO1 bioactivates an anti-cancer agent, Beta-lapachone and so this gene could be exploitable target for the treatment of cancer cells that overexpress this enzyme. After aCGH experiment, we did not reveal genomic imbalances in 9 of the 10 samples examined. In one semple we detected the loss of the Y chromosome. These results demonstrate that no specific genomic biomarkers are detectable for early stage prostatic cancer. Moreover, we studied NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2 expression by RT-PCR real-time in peripheral blood mononuclear cell fraction samples of 7 patients with prostate cancer. All thogether, our results showed an differential expression profiles of examinated genes. In particular, we found down regulation of PCK-beta and up regulation of ERBB2. In conclusion, this study allowed to identify prognosis biomarkers in primary cell lines and confirmed that ERBB2 gene can be use as prognosis marker in blood.

Obiettivi principali di questa tesi di dottorato sono lo studio dell’espressione genica e del profilo citogenetico, basato sulla tecnologia dei microarrays, per l’identificazione di potenziali biomarcatori genomici quali geni candidati per la comprensione della patogenesi molecolare del tumore della prostata, in linee primarie ottenute da campioni di carcinoma prostatico dopo rimozione chirurgica e lo studio degli eventuali geni differenzialmente espressi nelle colture primarie in linfociti estratti da sangue periferico di pazienti affetti da carcinoma prostatico e non trattati farmacologicamente, allo scopo di verificare se l’espressione differenziale è riscontrata anche nel sangue. E’ stato costruito un array a bassa densità costituito da 205 geni (“androchip”) selezionati sulla base del loro provato o potenziale ruolo nella cancerogenesi del carcinoma prostatico relazionati al pathway degli androgeni. E’ stata osservata un’alterata espressione dei geni coinvolti nella progressione verso l’androgeno indipendenza (BCL2, CALR e VIM) e nel contempo una diminuzione del gene PKC-beta, marcatore delle fasi iniziali della progressione del tumore. Inoltre è stato riscontrato un elevato aumento dell’espressione del gene NQO1. Questo gene è in grado di trasformare un farmaco anti tumorale, il β-lapacone, nella sua forma attiva e pertanto potrebbe essere un gene chiave nelle scelte terapeutiche da parte dei clinici. D’altro canto, dopo gli esperimenti di a-CGH non si è riscontrata alcuna anomalia a carico del corredo genomico delle linee primarie analizzate ad eccezione della perdita del cromosoma Y riscontrata in una linea primaria su dieci analizzate, prima con la piattaforma a BAC e confermata con la piattaforma Agilent a oligonucleotidi. Per quanto riguarda lo studio dei biomarcatori nel sangue di pazienti affetti da carcinoma prostatico, sono stati analizzati i geni NQO1, PKC-beta, BCL2 e ERBB2. Nel complesso i nostri dati hanno mostrato una effettiva variazione dell’espressione dei quattro geni esaminati. in particolare abbiamo riscontrato, in alcuni pazienti, una diminuzione dell’espressione di PCK-beta, gene ipo-espresso nelle primissime fasi della malattia e un aumento di espressione del gene ERBB2, gene correlato ad androgeno indipendenza e metastasi. In conclusione, questo lavoro ha portato all’individuazione di marcatori di prognosi sfavorevole in linee primarie ottenute da pazienti con carcinoma prostatico e all’identificazione e alla conferma del potenziale ruolo del gene ERBB2 come marcatore di prognosi nel sangue.