Clonaggio, espressione e caratterizzazione della porzione solubile di Anaerobic induced protein A (sAniA) di Neisseria meningitidis

Neisseria meningitidis is likely to be exposed to nitrosative stress during natural colonization in the human host and disease in general. Furthermore, N. meningitidis can live in the absence of oxygen replacing the aerobic pathway with nitrite (NO2-) based metabolism involving as a first step the activity of nitrite reductase (encoded by aniA gene). During the life cycles inside the host, for instance during mucosal invasion or during sepsis, N. meningitidis may continue to survive by the denitrificant pathway. Expression of the these genes by N. meningitidis during colonization and different phases of disease plays a crucial role in bacterial survival and thus in infection. On the basis of this knowledge, the present study evaluates sequence conservation in the gene coding for nitrite reductase (aniA) and AniA expression from a panel of Neisseria meningitidis isolates. Sequence analysis of the coding region in 19 disease-associated and 4 carrier strains notwithstanding a high degree of sequence similarity showed a number of nucleotide changes, some of which possibly resulted in premature translation termination or function loss. In particular, in one disease-associated strain a 9-residues insertion was found to be located close to the type I Cu-site and a catalytic histidine at position 280 was mutated into a leucine. In two strains from carriers, a sequence corresponding to a portion of a transposase gene within the aniA was also found. The AniA protein was always expressed, except for these two carriers strains and for other two strains in which the presence of the premature stop codons was recognized. The biochemical properties of the cloned soluble domain of the enzyme (sAniA) from N. meningitidis reference MC58 strain and from a clinical invasive isolate, were studied. In particular, biochemical analysis of sAniA from MC58 demonstrated a clear dependence of its catalytic activity upon acidification. The results suggest that the presence of a conserved and functional aniA gene is not essential for meningococcal survival.

Neisseria meninigitidis è facilmente esposto allo stress nitrosoattivo durante la colonizzazione e/o durante la malattia, ma può continuare a sopravvivere in ambienti poveri di ossigeno attraverso la via di denitrificazione. E' , inoltre, in grado di contrastare l'effetto tossico dell' ossido nitrico per la presenza della nitrito reduttasi (codificata dal gene aniA) primo anello del processo di denitrificazione. Questo studio ha, come scopo, quello di valutare la conservazione della sequenza nucleotidica e aminoacidica del gene aniA; l'espressione della proteina AniA di un gruppo di ceppi di N. meninigitidis isolati da casi di infezione meningococcica (invasivi) e da portatori (non invasivi). L' analisi della sequenza di 19 ceppi invasivi e in 4 ceppi non invasivi, ha mostrato un alto grado di somiglianza nonostante siano state trovate un certo numero di cambiamenti nucleotidici alcuni dei quali definiti codoni di stop ed altri responsabili di una perdita di attività dell' enzima. In particolare, in un ceppo invasivo (1332) è stata trovata una inserzione di 9 aminoacidi vicino al sito legante il rame di tipo I ed un cambiamento dell'istidina a leucina nel sito catalitico, in posizione 280. In due ceppi non invasivi è stata identificata una parte del gene codificante una trasposasi. Tutti i ceppi di meningococco rappresentanti le diverse alterazioni riconosciute nel gene aniA, esprimono, tuttavia, la proteina, eccetto in quei ceppi con una proteina incompleta. La crescita in vitro di ciascun ceppo di N. meningitidis è risultata essere paragonabile sia in presenza che in assenza di nitrito, ed il mancato consumo di nitrito, suggerisce che, nonostante la proteina venga espressa in tutti i ceppi, esiste probabilmente un difetto nel consumo di questo substrato da parte dellâ enzima AniA. Sono state studiate le proprietà biochimiche del dominio solubile dell' enzima AniA (sAniA) del ceppo di riferimento MC58, ottenuto clonando la sequenza del gene corrispondente nel vettore di espressione batterica pET28. In particolare, l' analisi biochimica di base di sAniA ha dimostrato una chiara dipendenza dell' attività catalitica in un ambiente acido. I risultati ci suggeriscono che la presenza del gene aniA conservato e funzionale non è indispensabile per la sopravvivenza del meningococco, nonostante questo enzima sia incluso in una via metabolica importante nel ciclo di vita di questo patogeno.