Different p63 mediated response induced by doxorubicin and cisplatin: P63 activation by c-Abl in the cisplatin induced apoptotic pathway

P53 family members have distinct and overlapping functions. P53 is involved in DNA damage response inducing cell cycle arrest or apoptosis. Also p73 induce cell growth arrest and apoptotic pathway after DNA damage. P63 is a member of p53 family, but little is known about its role in DNA damage response and in the cancer. It has reported that TAp63α is expressed in female germ cells and is essential in a process of DNA damage-induced oocyte death not involving p53. DNA damage induces p63 binding to p53 cognate DNA sites as judged by DNA binding assay performed on biotinylated double- strand oligonucleotide, and that these events seem linked to oocyte death. In this thesis we focus on the p63 mediated response to DNA damage response induced by different chemotherapeutic agents such as doxorubicin and cisplatin. We demonstrated that p63 protein undergoes posttranslational modification upon doxorubicin and cisplatin exposure. TAp63alpha isoform shows the reduction in electrophoretic mobility only after topoisomerase II inhibitors (doxorubicin and etoposide), whereas in the presence of cisplatin the TAp63alpha protein level is significantly increased. TAp63alpha upregulates different genes after doxorubicin compared to the cisplatin treatment, indeed upon cisplatin exposure TAp63 transactivates apoptotic genes and induce apoptosis whereas p63 does not upregulate genes involved in apoptosis and does not induce apoptosis upon doxorubicin exposure. In this thesis we analyzed, at molecular level, the TAp63 response triggered by cisplatin. In female germ line it has been described that DNA damage is communicated to p63 through phosphorylation (Suh, 2006). However, the upstream kinases are yet unknown. Here we show that, upon cisplatin treatment, TAp63 is phosphorylated by the phosphotyrosine kinase c-Abl on the tyrosine 149 in the proline rich region. Moreover we show, by RNA interference technique, that the p63 mediated upregulation of the genes involved in apoptosis and the induction of apoptosis, required the TAp63alpha phosphorylation by c-Abl.

I membri della famiglia di p53 hanno funzioni simili e differenti. La proteina p53 è coinvolta nella risposta al danno al DNA provocando arresto del ciclo cellulare o apoptosi. Anche p73 induce arresto del ciclo cellulare o apoptosi dopo un danneggiamento del DNA. P63 è un membro della famiglia di p53 ma si conosce poco circa il suo ruolo nella risposta al danno al DNA e nel cancro. TAp63α è espresso negli oociti ed è essenziale per provocare la morte degli oociti in seguito al danneggiamento del DNA senza coinvolgere p53. Il danno al DNA induce il legame di p63 alle sequenze di DNA riconosciute dai membri della famiglia di p53, come indicano esperimenti di oligonucleotidi biotinilati; questi eventi sembrano essere legati alla morte degli oociti. In questa tesi noi vogliamo studiare il ruolo di p63 nella risposta al danno al DNA provocato da diverse sostanze chemioterapeutiche come doxorubicina e cisplatino. Noi abbiamo dimostrato che la proteina p63 subisce delle modificazioni post-traduzionali in seguito all’uso di doxorubicina o cisplatino. Analizzando la corsa elettroforetica della proteina trattata con le sostanze chemoterapeutiche si nota che l’isoforma Tap63alfa mostra una riduzione nella corsa elettroforetica solo dopo aver somministrato inibitori della Topoisomerasi II (doxorubicina e etoposside), mentre in presenza di cisplatino la quantità di Tap63alfa appare significativamente aumentata. TAp63 alfa transattiva geni apoptosis e induce apoptosi se trattata con cisplatino. Il trattamento con doxorubicina invece non innesca in alcun modo l’apoptosi. In questa tesi noi analizziamo a livello molecolare la risposta di TAp63 provocata dal cisplatino. Nella linea germinale femminile (oociti) il danneggiamento del DNA provoca la fosforilazione di p63 (Suh, 2006). Tuttavia le chinasi coinvolte sono ancora sconosciute. Noi abbiamo dimostrato che, in seguito al trattamento con cisplatino, TAp63 è fosforilata dalla chinasi c-Abl sulla tirosina 149 in una regione ricca di proline. Inoltre, attraverso la tecnica del silenziamento dell’RNA, abbiamo descritto che la abilità di p63 di transattivare geni apoptotici e la capacità di indurre apoptosi richiede la sua fosforilazioneda da c-Abl.