Ruolo delle alterazioni mitocondriali nel processo di morte cellulare in patologie neurodegenerative

Apoptosis and autophagy are cell death pathways characterised by great modification of the cell structure, among which morphological and functional alterations of mitochondria. The loss of mitochondrial membrane potential (MMP) (Reed and Kroemer, 2000) could be considered both an early event towards apoptosis or a signal associated with autophagy of the organelles (Rodriguez-Enriquez et al., 2004). We previously observed that TG2 (Transglutaminase 2) over-expressing cells showed mitochondria that were greatly modified with respect to both their ultrastructure and physiology (Piacentini et al., 2002), with a constitutive hyperpolarization of the inner membrane. Even if TG2 expression is increased during apoptosis, the exact role of the enzyme in the cascade of events leading to cell death remain to be clarified. The first part of this thesis investigated, at a molecular level, the extension of TG2- mitochondrial modification as well as the possible interaction between TG2 and the proteins involved in the regulation of the mitochondrial pathway of apoptosis. The analysis of the TG2 primary sequence lead to the identification of a region with high homology with the BH3 domain of Bcl-2 family, to which belongs pro- and anti-apoptotic proteins. The biological role of the TG2 domain has been studied by means of cell-permeable peptides, mimicking the domain sequence. This kind of approach allow us to characterise the effect of TG2 at mitochondrial level, where it interacts with Bax and causes cytochrome c release. The obtained results suggest that TG2 might be a new kind of BH3-only protein and its modality of interaction and/or activation of Bax, place it in the so called “Bid-like” proteins. These proteins, by means of their BH3 domain, are direct activators of Bax and potentially able to regulate others Bcl-2 family members. At the same time our group had been studying the possible involvement of TG2 as a cell death modulator in Huntington’s disease (HD). In fact, it is known that over-expression of TG2 leads to cell death in human neuronal cells by inducing mitochondrial alterations and oxidative stress (Piacentini et al., 2002), but also by crossing HD R6/1 transgenic mice with TG2 knockout mice, a marked reduction in cell death is observed in R6/1, TG2 null when compared withR6/1 transgenic mice. The reduction in cell death is paralleled by a significant improvement in motor performances of R6/1, TG2 null versus R6/1 mice and extended survival (Mastroberardino et al., 2002). However this is independent from TG2 capability to make intranuclear inclusions by its cross-linking activity (Bailey and Johnson, 2005). The degenerative process of Huntington disease, relies both on the acquisition of toxic function by mutated huntingtin (htt) as well as on the loss of protection exerted by the wild type protein. Both these events lead to a lot of cellular alterations, which involve also mitochondria and they lead to cell death by apoptosis and/or autophagy. The second part of this thesis deal with the study of mitochondrial alterations observed in lymphocyte derived from HD patients. Lymphoblasts display some characteristics observed in HD neurons, otherwise, as they are not involved in neurodegenerative process, they allow a direct analysis of mutated htt effects in respect to the wild-type one as well as the effect of the mutation in hetero- and homo-zygosis. Recent evidences suggested that, the faster progression of the disease observed in homozygous patients, might be due to the presence in double dose of the mutated protein, coupled to the complete loss of the wild type one’s protective role (Squitieri et al., 2003). The second part of this thesis analyzes the different cell death pathways and the mitochondrial alterations in HD cell lines, through comparative study between heterozygous and homozygous patients. The results obtained show that in both cases we can observe plain and remarkable morfologial-functional alterations of mitochondria that correlates with the genotype of the patient.

I processi di morte cellulare sono caratterizzati da profondi cambiamenti morfologico-funzionali delle diverse componenti cellulari. In queste condizioni i mitocondri vanno incontro ad una serie di evidenti alterazioni, tra le quali la perdita del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) (Reed and Kroemer, 2000) può rappresentare sia un evento precoce dei processi di apoptosi sia un segnale associato all’autofagocitosi degli organelli stessi (Rodriguez-Enriquez et al., 2004). Nel nostro gruppo è stato osservato che cellule di neuroblastoma umano (TGA) iper-esprimenti la Ttransglutaminasi di tipo 2 (TG2), presentavano alterazioni sia nell’ultrastuttura sia nella fisiologia dei mitocondri (Piacentini et al., 2002), tra cui una iperpolarizzazione costitutiva della membrana interna. Benché l’espressione della TG2 venga indotta durante i processi di morte cellulare per apoptosi, il ruolo di questo enzima nella cascata di eventi che inducono la cellula a morire, non è stata ancora completamente chiarito. Lo scopo di parte di questa tesi di dottorato è stato quello di verificare, a livello molecolare, quali fossero le modificazioni TG2-dipendenti dei mitocondri e le eventuali interazioni con proteine implicate nella regolazione della via mitocondriale dell’apoptosi. L’analisi della sequenza primaria della TG2 ha portato all’identificazione di una regione con un’elevata omologia col dominio BH3 delle proteine della famiglia di Bcl-2, le quali controllano l’omeostasi mitocondriale e mediano il rilascio dei fattori pro- ed anti-apoptotici dai mitocondri. Il ruolo biologico di questo dominio della TG2 è stato studiato mediante l’utilizzo di peptidi in grado di penetrare la cellula e mimare l’azione del dominio stesso. Questa strategia ha rivelato come la TG2 sia in grado di interagire con Bax a livello mitocondriale e mediante questa interazione provocare la fuoriuscita del citocromo c dagli organelli. La prima parte dei risultati presentati in questa tesi, analizzano l’azione della TG2 e suggeriscono che essa possa essere un nuovo tipo di proteina “BH3-only” e le modalità della sua interazione e/o attivazione di Bax, la collocano esattamente tra le così dette “Bid-like proteins”. Queste proteine, tramite il loro dominio BH3, sono in grado di attivare in modo diretto Bax e sono potenzialmente in grado di regolare la funzionalità si altri membri della famiglia di Bcl-2. Contestualmente, il nostro gruppo si è occupato dello studio del possibile coinvolgimento della TG2 come modulatore della morte cellulare nella corea di Huntington (HD), una patologia caratterizzata da notevoli disfunzioni mitocondriali. Malgrado l’iper-espressione della TG2 induca alterazioni mitocondriali e stress ossidativo favorendo la morte cellulare (Piacentini et al., 2002), l’incrocio di topi transgenici (HD) R6/1 con i topi knock out per la TG2, evidenzia una riduzione della morte cellulare, un significativo miglioramento della motilità degli animali ed una prolungata sopravvivenza (Mastroberardino et al., 2002). Questo effetto è comunque indipendente dalla capacità dell’attività transamidasica della TG2 a formare le caratteristiche inclusioni intranucleari osservate nella patologia (Bailey and Johnson, 2005). Nella corea di Huntington, la degenerazione cellulare sembra dipendere dall’acquisizione di funzione tossica da parte dell’huntingtina mutata e la perdita di funzione protettiva da parte della proteina normale. Entrambi questi eventi portano a numerose alterazioni cellulari, che coinvolgono anche i mitocondri. Tali alterazioni possono indurre morte cellulare, che può manifestarsi sia come apoptosi sia come autofagia. La seconda parte di questa tesi riguarda lo studio dell’effetto delle alterazioni mitocondriali che si riscontrano in linfociti derivati da pazienti affetti da HD. I linfoblasti presentano alcune delle caratteristiche osservate nei neuroni HD, d'altra parte, non essendo interessati dal processo degenerativo, permettono sia un'analisi diretta degli effetti dell'htt mutata rispetto a quella wild-type sia l’effetto della mutazione in etero- ed omo-zigosi. Infatti, recenti evidenze, hanno evidenziato una più rapida progressione della malattia nei pazienti omozigoti (Squitieri et al., 2003) probabilmente imputabile alla presenza in doppia dose della proteina mutata ed alla totale mancanza del ruolo protettivo svolto dall'htt normale. Nella seconda parte di questa tesi sono state analizzate le diverse vie di morte cellulare e le alterazioni mitocondriali attraverso uno studio comparativo tra eterozigoti e omozigoti. In entrambi i casi si osservano evidenti e significative alterazioni morfologico-funzionali dei mitocondri che correlano con il genotipo delle linee cellulari.