Analisi molecolare e funzionale della variabilità del gene della succinico semialdeide deidrogenasi (SSADH) umana

SSADH is a mitochondrial NAD+-dependent enzyme and serves its major role in the catabolism of the GABA, the most important inhibitory neurotransmitter of the Central Nervous System (CNS), by oxidation of the substrate succinic semialdehyde (SSA) to succinate which enters the Krebs cycle; SSA can be also converted into 4-hydroxybutyric acid (GHB) by tissue specific SSA reductases. Complete SSADH deficiency results in 4-hydroxybutyric aciduria, a rare recessive autosomal disorder of human metabolism. 4-HBA patients manifest a considerable variability of the clinical phenotype, ranging from mild psychomotor retardation to severe neurological defects, due to the neurotoxic effects of the abnormal accumulation of GABA and GHB in tissues and physiologic fluids. Recent studies reveal a second role of SSADH: it is one of the two mitochondrial aldehyde dehydrogenases responsible of detoxification of 4-hydroxy-2-nonenal (HNE). HNE is a reactive aldehyde physiologically produced in relatively large amounts from lipid peroxidation. Elevated levels of HNE in CNS are implicated in the pathogenesis of numerous neurodegenerative disorders such as Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. By studying more than 50 SSADH deficient families, we identified several pathological variants. We also identified not pathological variants in the coding region. Some of the polymorphic variants are rare and some reach polymorphic frequencies: the G to C transversion in position c.106 and C to T transitions in positions c.538 and c.545. Resequencing non human primates DNA, we identified the ancestral and derived alleles for each polymorphic site and we identified those that occurred in the human specific lineage. We observed that both ancestral and derived alleles for the positions c.106 and c.545 are present in almost all human populations and that the ancestral allele is more frequent; whereas the derived allele at the position c.538 has increased its frequency and now represent the majority in human populations. Resequencing families and single subjects, we obtained 3 different haplotypes for the most common polymorphisms (c.106 G>C, c.538 C>T and c.545 C>T): haplotype 1 (GCC), haplotype 4 (GTC) and haplotype 5 (CTT). We performed transient transfections with cDNAs corresponding to these three haplotypes into HEK293 cell line. The enzyme activity associated with the three haplotypes showed the same efficiency when the substrate was SSA or HNE. When expressing SSADH activity of haplotypes 4 and 5 as percentage of haplotype 1 (100%), they produced 62-72% and 23% of the activity, respectively, using SSA and HNE as substrates. In order to characterized the SSADH promoter region we analysed about 100 subjects of different geographic origins; we identified nine variant positions and obtained the reconstruction of haplotypes and their frequencies. The haplotypes were subcloned in an expression vector with luciferase as reporter gene and named BK31, BK45 and BK70; we obtained the following results: clone BK31 showed the highest activity (100%) while the others, BK45 and 70, showed about 50% of the activity with respect to BK31. Another aim of this study was to confirm the second role of SSADH verifying whether it confers protection against HNE and other oxidants. We obtained stable transfected cell lines overexpressing haplotype 1 of SSADH coding region with different gene-dosage. For each stable cell line we measured RNA expression and enzyme activity, on both SSA and HNE as substrates. We observed that the difference in RNA expression levels parallels the difference in enzyme activities. Using MTT assay as a measure of cell viability, we observed that the stable transfected cell lines, showing the highest enzyme activity, showed also a significant increase of cell viability after treatment with different concentrations of HNE and H2O2, confirming a very high efficacy of SSADH overexpressing cells in detoxification. We concluded that both coding and promoter regions show a very high variability in the human population and some haplotype variant reduce the enzyme activity up to 50% of the most common ones. We confirmed the second role of ALDH5A in the protection against HNE and other oxidants.

L’SSADH è un enzima mitocondriale NAD+-dipendente e svolge il suo ruolo principale nel catabolismo del GABA, il principale neurotrasmettitore inibitore del Sistema Nervoso Centrale (SNC), attraverso l’ossidazione del substrato succinico semialdeide (SSA) a succinato, il quale a sua volta entra nel ciclo di Krebs; l’SSA può essere anche convertito nell’acido 4-idrossibutirrico (GHB) da SSA reduttasi tessuto-specifiche. La deficienza completa di SSADH risulta nella 4-idrossibutirrico aciduria (4-HBA), una rara malattia autosomica recessiva del metabolismo umano. I malati di 4-HBA manifestano un’ampia variabilità di fenotipi clinici, che vanno dal ritardo psicomotorio a gravi difetti neurologici, dovuti agli effetti neurotossici dell’anormale accumulo di GABA e GHB nei tessuti e nei liquidi fisiologici. Studi recenti hanno rivelato un secondo ruolo dell’SSADH: essa è una delle due aldeidi deidrogenasi mitocondriali responsabili della detossificazione del 4-idrossi-2-nonenale (HNE). L’HNE è un’aldeide reattiva prodotta fisiologicamente in quantità relativamente elevate in seguito a perossiadazione lipidica. Livelli elevati di HNE nel Sistema Nervoso Centrale sono implicati nella patogenesi di numerose malattie neurodegenerative quali la malattia di Parkinson e di Alzheimer. Dallo studio di più di 50 famiglie deficienti di SSADH, abbiamo identificato numerose varianti patologiche. Abbiamo anche identificato varianti non patologiche nella regione codificante. Alcune di queste sono rare e altre mostrano frequenze polimorfiche come ad esempio la trasversione da G a C in posizione 106 e la transizione da C a T nelle posizioni 538 e 545. Tramite il sequenziamento del DNA di primati non umani, abbiamo identificato gli alleli ancestrali e derivati per ciascun tipo polimorfico e abbiamo identificato quelli che si trovano in modo specifico nella linea umana. Abbiamo osservato che per le posizioni c.106 e c.545 è presente sia l’allele ancestrale che quello derivato in quasi tutte le popolazioni umane e che l’allele ancestrale è quello più frequente; invece per la posizione c.538 l’allele derivato ha aumentato la propria frequenza e ora è quello più comune nella popolazione umana. Dal sequenziamento di famiglie e singoli individui abbiamo ottenuto 3 differenti aplotipi per i tre polimorfismi più comuni (c.106 G>C, c.538 C>T and c.545 C>T): l’aplotipo 1 (GCC), l’aplotipo 4 (GTC) e l’aplotipo 5 (CTT). Abbiamo effettuato trasfezioni transienti con i cDNA corrispondenti a questi tre aplotipi nella linea cellulare HEK293. L’attività enzimatica associata ai tre aplotipi ha mostrato la stessa efficienza sia con il substrato SSA che HNE. Esprimendo l’attività SSADH degli aplotipi 4 e 5 come percentuale dell’aplotipo 1 (100%), questi hanno prodotto un’attività pari rispettivamente al 62-72% e 23-25%, usando l’SSA e l’HNE come substrati. Per caratterizzare la regione del promotore del gene SSADH abbiamo analizzato circa 100 individui di differente origine geografica identificando così nove posizioni varianti e ricostruendo gli aplotipi e le loro frequenze. Gli aplotipi sono stati subclonati in un vettore d’espressione che avesse la luciferasi come gene reporter e sono stati chiamati BK31, BK45 e BK70; abbiamo ottenuto i seguenti risultati: il clone BK31 ha mostrato l’attività più alta (100%) mentre gli altri,BK45 and 70, hanno mostrato circa il 50% dell’attività rispetto a BK31. Altro scopo di questo studio è stato quello di confermare il secondo ruolo dell’SSADH verificando se conferisce protezione contro l’HNE e altri agenti ossidanti. Abbiamo ottenuto linee cellulari trasfettate stabilmente che overesprimessero l’aplotipo 1 della regione codificante del gene SSADH con differente dosaggio genico. Per ciascuna linea stabile abbiamo misurato l’espressione dell’RNA e l’attività enzimatica utilizzando sia il substrato SSA che l’HNE. Per ciascuna linea cellulare abbiamo osservato che la differenza nei livelli di espressione dell’RNA è in accordo con la differenza nell’attività enzimatica. Usando il saggio MTT come misura della capacità di sopravvivenza cellulare, abbiamo osservato che le linee cellulari con la più alta attività enzimatica mostravano anche una maggiore resistenza al trattamento con differenti dosaggi di HNE and H2O2, confermando che le cellule che overesprimono SSADH sono anche le più effficienti nella detossificazione. Abbiamo quindi concluso che sia la regione codificante che quella del promotore del gene SSADH presentano una variabilità molto elevata nella popolazione umana e che alcune varianti aplotipiche riducono l’attività enzimatica fino al 50% rispetto a quella dell’aplotipo più comune. Abbiamo inoltre confermato il secondo ruolo dell’SSADH nel proteggere le cellule dall’HNE e altri agenti ossidanti.