In male mammals, development and differentiation of the germline is a dynamic process. Primordial germ cells (PGCs) migrate to the developing testis where they form prospermatogonia that subsequently enter mitotic arrest and remain in this state for the duration of fetal development. After birth in the mouse, these cells resume mitotic activity to form stem spermatogonia. The spermatogonial stem cell population replicates mitotically to both maintain itself and ultimately give rise to differentiating spermatogonia that enter meiosis as primary spermatocytes, proceed through the meiotic divisions and yield postmeiotic spermatids that differentiate via the process of spermiogenesis to form spermatozoa. (Jeremy Wang et al, 2005). Transcriptional and translational control plays a crucial role during the spermatogenesis. Studies of uridine-H3 labelling.in mouse have revealed that RNA synthesis occurs in spermatogonia, is very low in early meiotic prophase: leptotene, zygotene and in the first half of pachytene, rises rapidly to a peak in middle-late pachytene and decreses again in diplotene. After meiosis, RNA synthesis is resumed in early spermiogenesis but stops completely in mid-spermiogenesis after the beginning of nuclear elongation. ( Monesi et al 1978).Protein synthesis occurs at nearly all stages of spermatogenesis in the mouse, in particular during the pachytene stage of meiosis (Monesi, 1965, 1967) and in elongating spermatids. Translational control plays a key role in temporal regulation of development events during spermatogenesis. An important regulatory point for translational control in eukaryotes is initiation, instigated by binding of the translational initiation complex to the V cap of the mRNA,leading to recruitement of the ribosomal subunits. The aim of this project was to understand whether biochemical data of translational activity correlate with those of [35S]methionine incorporations and to investigate how the translation activity is regulated at the molecular level, in particular at the level of the initiation complex formation, in different cell types during spermatogenesis. First of all we re-evaluated the rate of [35S]methionine incorporation in germ cells at different developmental stages. We observed an highest [35S]methionine incorporation in spermatocytes compared to haploid cells, high levels of S6 phosphorylation ( a well known marker of active translation ) in spermatocytes, which is reduced in round spermatids, and which increase again in elongating spermatids, evaluated by immunoblot analisys. Immunocytochemical analisys indicate a strong level of S6 phosphorylation in middle-late pachytene spermatocytes, in spermatocytes undergoing the meiotic divisions and in elongated spermatids. Immunoreactivity is low in early meiotic cells, in the cytoplasm of round spermatids and spermatozoa near to the spermiation step. All these data indicate that during spermatogenesis there are two moments of high translational activity, one in late pachytene spermatocytes and one during spermatid elongation, separated by a period of reduced protein synthesis corresponding with the beginning of the haploid stage of spermatogenesis. Active translation in late pachytene spermatocytes, is supported by the increase of phosphorylation state of Akt, S6 and eIF4E after OA treatment, which is known to push meiotic progression of spermatocytes and their entry into methaphase I (MI), and an increase in the binding to m7-GTPsepharose beads of all the factors that take active part to the formation of the translational initiation complex (eIF4G, PABP and eIF4A). We observed a reduction of protein synthesis of 20% in spermatocytes, after pre-incubation with rapamycin or Mnk inhibitor but not in round spermatids seen by [35S]methionine incorporation experiments. Morover the binding of eIF4F components to m7-GTP-sepharose beads (mimicking the cap mRNA structure) after treatment of rapamycin or Mnk inhibitor decreases in spermatocytes and in elongating spermatids but not in round spermatids.These data suggest that, while translational activity of spermatocytes is partially regulated by mTor and Erk pathways, this regulation is not occurring in round spermatids. However this conclusion is not supported by the analysis of the binding of initiation factors to m7-GTP-sepharose beads (mimicking the cap mRNA structure), which shows that there are no apparent differences between spermatocytes and round spermatids. Thus, a delay in the elongation step of translation, rather than reduced formation of initiation complexes, might account for the decrease in the rate of protein synthesis at the beginning of the haploid phase of spermatogenesis.

Nei mammiferi lo sviluppo e il differenziamento della linea germinale maschile è un processo dinamico. Le cellule germinali primordiali (PGC), migrano nel testicolo in sviluppo dove formano i prospermatogoni che entrano in arresto mitotico per tutta la durata dello sviluppo fetale. Dopo la nascita queste cellule riprendono l’attività mitotica per formare gli spermatogoni. Le cellule staminali spermatogoniali si replicano mititicamente per rigenerare se stesse e per dare origine a spermatogoni differenzianti che entrano in meiosi per dare spermatociti primari i quali procedono attraverso le divisioni meiotiche fino allo stadio di spermatidi apolidi. Questi ultimi poi differenziano attraverso la spermiogenesi per formare spermatozoi maturi (Jeremy Wang et al,2005). Il controllo trascrizionale e traduzionale, gioca un ruolo cruciale durante la spermatogenesi. Studi di marcatura di uridina H3, nel topo hanno rivelato che la sintesi di RNA avviene negli spermatogoni, è molto bassa nella profase meiotica precoce:leptotene, zigotene e nella prima metà del pachitene, aumenta rapidamente nel pachitene tardivo e decrementa di nuovo in diplotene. Dopo la meiosi la sintesi di RNA riprende nella spermiogenesi precoce, ma si ferma completamente negli spermatidi in allungamento. La sintesi proteica avviene a quasi tutti gli stadi della spermatogenesi ed in particolare durante il pachitene della meiosi e negli spermatidi in allungamento. Il controllo traduzionale gioca un ruolo chiave nella regolazione temporale degli eventi di sviluppo durante la spermatogenesi. Un meccanismo di regolazione importante per il controllo traduzionale negli eucarioti è la formazione del complesso d’inizio traduzionale al quinto cap dell’mRNA che guida al reclutamento della subunità ribosomale. Lo scopo del progetto è stato di comprendere se i dati biochimici dell’attività traduzionale, correlassero con quelli d’incorporazione della metionina [35S] e di indagare come l’attività traduzionale fosse regolata a livello molecolare ed in particolare al livello della formazione del complesso d’inizio nei diversi tipi cellulari durante la spermatogenesi. Prima di tutto abbiamo valutato il tasso d’incorporazione della metionina marcata nelle cellule germinali a diversi stadi di sviluppo. Abbiamo osservato un’elevata incorporazione di metionina[35S] negli spermatociti paragonata agli spermatidi apolidi, elevati livelli di fosforilazione di S6 (un noto marker d’attività tradizionale), negli sprematociti, ma non negli spermatici rotondi, con un leggero incremento negli spermatidi in allungamento. Analisi di immunoistichimica indicano un forte livello di fosforilazione di S6 negli spermatociti in pachitene tardivo, negli spermatociti che stanno per entrare in divisione meiotica e negli spermatidi in allungamento. L’immunoreattività è bassa nelle cellule meiotiche precoci, negli spermatidi rotondi e negli spermatozoi. Tutti questi dati indicano che durante la spermatogenesi ci sono due momenti di elevata attività traduzionale, uno negli spermatociti in pachitene tardivo ed uno negli spermatidi in allungamento separati da un periodo di ridotta sintesi proteica che corrisponde all’inizio della fase apolide della spermatogenesi. L’attivazione traduzionale negli spermatociti in pachitene è supportata dall’incremento della fosforilazione di Akt, S6 e eIF4E dopo trattamento con OA (che è noto indurre la progressione meiotica degli spermatociti ed il loro ingresso in metafase I) ed un incremento nel legame dei componenti (eIF4G,PABP and eIF4A) del complesso d’inizio tradizionale (eIF4F) alla resina m7-GTP-sepharose che mima la struttura del cap. Abbiamo osservato inoltre una riduzione della sintesi proteica di 20% negli spermatociti dopo preincubazione con rapamicina e l’inibitore di Mnk, ma non negli spermatidi rotondi, mediante incorporazione di metionina marcata. Inoltre il legame dei componenti di eIF4F alla resina m7-GTP-sepharose dopo trattamento con rapamicina o l’inibitore di Mnk decrementa negli spermatociti e negli spermatidi in allungamento, ma non negli spermatidi rotondi. Questi dati suggeriscono che mentre l’attività traduzionale degli spermatociti è parzialmente regolata dal pathway di mTor e Erk, tale regolazione non avviene negli spermatidi rotondi. Tuttavia questa conclusione non è supportata dall’analisi del legame dei fattori d’inizio traduzionale al cap che risulta essere uguale negli spermatociti e negli spermatidi rotondi. Quindi un ritardo nello step di allungamento della traduzione piuttosto che una ridotta formazione del complesso d’inizio potrebbe spiegare il decremento nella sintesi proteica all’inizio della fase apolide della spermatogenesi.

Di Sauro, A. (2008). Regolazione dell'espressione genica nelle cellule germinali maschili.

Regolazione dell'espressione genica nelle cellule germinali maschili

DI SAURO, ANNARITA
2008-05-29

Abstract

Nei mammiferi lo sviluppo e il differenziamento della linea germinale maschile è un processo dinamico. Le cellule germinali primordiali (PGC), migrano nel testicolo in sviluppo dove formano i prospermatogoni che entrano in arresto mitotico per tutta la durata dello sviluppo fetale. Dopo la nascita queste cellule riprendono l’attività mitotica per formare gli spermatogoni. Le cellule staminali spermatogoniali si replicano mititicamente per rigenerare se stesse e per dare origine a spermatogoni differenzianti che entrano in meiosi per dare spermatociti primari i quali procedono attraverso le divisioni meiotiche fino allo stadio di spermatidi apolidi. Questi ultimi poi differenziano attraverso la spermiogenesi per formare spermatozoi maturi (Jeremy Wang et al,2005). Il controllo trascrizionale e traduzionale, gioca un ruolo cruciale durante la spermatogenesi. Studi di marcatura di uridina H3, nel topo hanno rivelato che la sintesi di RNA avviene negli spermatogoni, è molto bassa nella profase meiotica precoce:leptotene, zigotene e nella prima metà del pachitene, aumenta rapidamente nel pachitene tardivo e decrementa di nuovo in diplotene. Dopo la meiosi la sintesi di RNA riprende nella spermiogenesi precoce, ma si ferma completamente negli spermatidi in allungamento. La sintesi proteica avviene a quasi tutti gli stadi della spermatogenesi ed in particolare durante il pachitene della meiosi e negli spermatidi in allungamento. Il controllo traduzionale gioca un ruolo chiave nella regolazione temporale degli eventi di sviluppo durante la spermatogenesi. Un meccanismo di regolazione importante per il controllo traduzionale negli eucarioti è la formazione del complesso d’inizio traduzionale al quinto cap dell’mRNA che guida al reclutamento della subunità ribosomale. Lo scopo del progetto è stato di comprendere se i dati biochimici dell’attività traduzionale, correlassero con quelli d’incorporazione della metionina [35S] e di indagare come l’attività traduzionale fosse regolata a livello molecolare ed in particolare al livello della formazione del complesso d’inizio nei diversi tipi cellulari durante la spermatogenesi. Prima di tutto abbiamo valutato il tasso d’incorporazione della metionina marcata nelle cellule germinali a diversi stadi di sviluppo. Abbiamo osservato un’elevata incorporazione di metionina[35S] negli spermatociti paragonata agli spermatidi apolidi, elevati livelli di fosforilazione di S6 (un noto marker d’attività tradizionale), negli sprematociti, ma non negli spermatici rotondi, con un leggero incremento negli spermatidi in allungamento. Analisi di immunoistichimica indicano un forte livello di fosforilazione di S6 negli spermatociti in pachitene tardivo, negli spermatociti che stanno per entrare in divisione meiotica e negli spermatidi in allungamento. L’immunoreattività è bassa nelle cellule meiotiche precoci, negli spermatidi rotondi e negli spermatozoi. Tutti questi dati indicano che durante la spermatogenesi ci sono due momenti di elevata attività traduzionale, uno negli spermatociti in pachitene tardivo ed uno negli spermatidi in allungamento separati da un periodo di ridotta sintesi proteica che corrisponde all’inizio della fase apolide della spermatogenesi. L’attivazione traduzionale negli spermatociti in pachitene è supportata dall’incremento della fosforilazione di Akt, S6 e eIF4E dopo trattamento con OA (che è noto indurre la progressione meiotica degli spermatociti ed il loro ingresso in metafase I) ed un incremento nel legame dei componenti (eIF4G,PABP and eIF4A) del complesso d’inizio tradizionale (eIF4F) alla resina m7-GTP-sepharose che mima la struttura del cap. Abbiamo osservato inoltre una riduzione della sintesi proteica di 20% negli spermatociti dopo preincubazione con rapamicina e l’inibitore di Mnk, ma non negli spermatidi rotondi, mediante incorporazione di metionina marcata. Inoltre il legame dei componenti di eIF4F alla resina m7-GTP-sepharose dopo trattamento con rapamicina o l’inibitore di Mnk decrementa negli spermatociti e negli spermatidi in allungamento, ma non negli spermatidi rotondi. Questi dati suggeriscono che mentre l’attività traduzionale degli spermatociti è parzialmente regolata dal pathway di mTor e Erk, tale regolazione non avviene negli spermatidi rotondi. Tuttavia questa conclusione non è supportata dall’analisi del legame dei fattori d’inizio traduzionale al cap che risulta essere uguale negli spermatociti e negli spermatidi rotondi. Quindi un ritardo nello step di allungamento della traduzione piuttosto che una ridotta formazione del complesso d’inizio potrebbe spiegare il decremento nella sintesi proteica all’inizio della fase apolide della spermatogenesi.
A.A. 2007/2008
Biotecnologie della riproduzione e dello sviluppo
20.
In male mammals, development and differentiation of the germline is a dynamic process. Primordial germ cells (PGCs) migrate to the developing testis where they form prospermatogonia that subsequently enter mitotic arrest and remain in this state for the duration of fetal development. After birth in the mouse, these cells resume mitotic activity to form stem spermatogonia. The spermatogonial stem cell population replicates mitotically to both maintain itself and ultimately give rise to differentiating spermatogonia that enter meiosis as primary spermatocytes, proceed through the meiotic divisions and yield postmeiotic spermatids that differentiate via the process of spermiogenesis to form spermatozoa. (Jeremy Wang et al, 2005). Transcriptional and translational control plays a crucial role during the spermatogenesis. Studies of uridine-H3 labelling.in mouse have revealed that RNA synthesis occurs in spermatogonia, is very low in early meiotic prophase: leptotene, zygotene and in the first half of pachytene, rises rapidly to a peak in middle-late pachytene and decreses again in diplotene. After meiosis, RNA synthesis is resumed in early spermiogenesis but stops completely in mid-spermiogenesis after the beginning of nuclear elongation. ( Monesi et al 1978).Protein synthesis occurs at nearly all stages of spermatogenesis in the mouse, in particular during the pachytene stage of meiosis (Monesi, 1965, 1967) and in elongating spermatids. Translational control plays a key role in temporal regulation of development events during spermatogenesis. An important regulatory point for translational control in eukaryotes is initiation, instigated by binding of the translational initiation complex to the V cap of the mRNA,leading to recruitement of the ribosomal subunits. The aim of this project was to understand whether biochemical data of translational activity correlate with those of [35S]methionine incorporations and to investigate how the translation activity is regulated at the molecular level, in particular at the level of the initiation complex formation, in different cell types during spermatogenesis. First of all we re-evaluated the rate of [35S]methionine incorporation in germ cells at different developmental stages. We observed an highest [35S]methionine incorporation in spermatocytes compared to haploid cells, high levels of S6 phosphorylation ( a well known marker of active translation ) in spermatocytes, which is reduced in round spermatids, and which increase again in elongating spermatids, evaluated by immunoblot analisys. Immunocytochemical analisys indicate a strong level of S6 phosphorylation in middle-late pachytene spermatocytes, in spermatocytes undergoing the meiotic divisions and in elongated spermatids. Immunoreactivity is low in early meiotic cells, in the cytoplasm of round spermatids and spermatozoa near to the spermiation step. All these data indicate that during spermatogenesis there are two moments of high translational activity, one in late pachytene spermatocytes and one during spermatid elongation, separated by a period of reduced protein synthesis corresponding with the beginning of the haploid stage of spermatogenesis. Active translation in late pachytene spermatocytes, is supported by the increase of phosphorylation state of Akt, S6 and eIF4E after OA treatment, which is known to push meiotic progression of spermatocytes and their entry into methaphase I (MI), and an increase in the binding to m7-GTPsepharose beads of all the factors that take active part to the formation of the translational initiation complex (eIF4G, PABP and eIF4A). We observed a reduction of protein synthesis of 20% in spermatocytes, after pre-incubation with rapamycin or Mnk inhibitor but not in round spermatids seen by [35S]methionine incorporation experiments. Morover the binding of eIF4F components to m7-GTP-sepharose beads (mimicking the cap mRNA structure) after treatment of rapamycin or Mnk inhibitor decreases in spermatocytes and in elongating spermatids but not in round spermatids.These data suggest that, while translational activity of spermatocytes is partially regulated by mTor and Erk pathways, this regulation is not occurring in round spermatids. However this conclusion is not supported by the analysis of the binding of initiation factors to m7-GTP-sepharose beads (mimicking the cap mRNA structure), which shows that there are no apparent differences between spermatocytes and round spermatids. Thus, a delay in the elongation step of translation, rather than reduced formation of initiation complexes, might account for the decrease in the rate of protein synthesis at the beginning of the haploid phase of spermatogenesis.
spermatogenesis; Mnk1; translation regulation; mRNA; mTor
Settore MED/03 - Genetica Medica
English
Tesi di dottorato
Di Sauro, A. (2008). Regolazione dell'espressione genica nelle cellule germinali maschili.
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
TESI-Dottorato-Annarita_Di_Sauro-AA2008 TuttiDocs.pdf

accesso aperto

Dimensione 2.68 MB
Formato Adobe PDF
2.68 MB Adobe PDF Visualizza/Apri

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/2108/515
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact