Molecular mechanisms involved in spermatogonial germ cells proliferation and differentiation

The aim of this work is to understand some of the molecular mechanisms which regulate spermatogonial germ cells proliferation and differentiation in the prepuberal mouse testis. In this study we characterized the RNA-binding protein Nanos3 and its role in the regulation of spermatogonial cell-cycle progression. Furthermore we performed a transcriptome analysis of spermatogonia stimulated with KL and retinoic acid, which have been previously shown to regulate their proliferaton and differentiaton, respectively. In the mouse, three Nanos homologs have been identified, Nanos1, Nanos2 and Nanos3. The Nanos3 ortholog is expressed in both male and female gonads of early embryo and, after birth, it is found only in the testis. Nanos3 targeted disruption results in the complete loss of germ cells in both sexes during embryonic development, however the role of Nanos3 in the testis during the postnatal period has not been explored yet. We found that Nanos3 is expressed in undifferentiated spermatogonia of the prepuberal testis and that its up-regulation causes accumulation of cells in the G1 phase, suggesting that this protein is able to delay the cell cycle progression of spermatogonial cells. We also demonstrate a conserved mechanism of action of Nanos3 as potential translational repressor, involving the interaction with the murine RNA-binding protein Pumilio2. According to the possible role of Nanos3 in inhibiting spermatogonia cell differentiation, treatment with the differentiating factor all-trans retinoic acid (ATRA) induces a dramatic down-regulation of its expression. These results allowed us to conclude that, in the prepuberal testis, Nanos3 is important to maintain undifferentiated spermatogonia via the regulation of their cell cycle. In the second part of the work we performed a wide genome analysis of gene expression regulated by treatment with KL or ATRA of spermatogonia from 7-day-old mice. The analysis revealed that the pattern of RNA expression induced by KL is compatible with the qualitative changes of the cell cycle that occur during the subsequent cell divisions in type A and B spermatogonia. Moreover, KL up-regulates in differentiating spermatogonia the expression of early meiotic genes whereas it down-regulates typical spermatogonial markers. Since KL modifies the expression of several genes known to be up-regulated or down-regulated in spermatogonia during the transition from the mitotic to the meiotic cell cycle, these results are consistent with a role of the KL/Kit interaction in the induction of their meiotic differentiation. Microarray analysis on stimulated spermatogonia showed that ATRA induces a pattern of gene expression which is compatible with their ongoing differentiating program toward meiosis, suggesting that ATRA and KL, independently, are able to promote meiotic entry of postnatal spermatogonia.

Lo scopo del seguente lavoro, è comprendere alcuni dei meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione della proliferazione e del differenziamento degli spermatogoni nel testicolo prepuberale di topo. Lo studio ha riguardato la caratterizzazione della RNA-binding-protein Nanos 3 e il suo coinvolgimento nella progressione del ciclo cellulare degli spermatogoni e l’analisi dell’espressione genica negli spermatogoni in seguito a trattamento con i fattori Kit ligand e acido retinico, coinvolti rispettivamente nella proliferazione e nel differenziamento in questo tipo cellulare. Nel topo sono stati identificati tre omologhi di Nanos , Nanos1, Nanos2 and Nanos3. L’ortologo Nanos3 è espresso nella gonade embrionale maschile e femminile e dopo la nascita è presente esclusivamente nel testicolo. E’ noto che l’eliminazione di questo gene comporta la perdita completa della cellule germinali in entrambi i sessi, ma la funzione di Nanos3 nel testicolo dopo la nascita, non è stata ancora analizzata. Nel nostro studio dimostriamo che Nanos3 è espresso negli spermatogoni indifferenziati del testicolo prepuberale di topo e che l’over espressione di questo gene comporta un aumento della percentuale di cellule nella fase G1, suggerendone il coinvolgimento nel rallentamento della progressione del ciclo cellulare degli spermatogoni. Dimostriamo inoltre, che il meccanismo di azione di Nanos 3, quale potenziale repressore della traduzione, è conservato nel topo e prevede l’interazione con una seconda RNA-binding protein murina, Pumilio2. In accordo con il possibile coinvolgimento di Nanos 3 nell’inibizione del differenziamento degli spermatogoni, il trattamento con il fattore differenziativo acido retinoico all-trans (ATRA), induce una notevole down-regolazione della sua espressione. Questi risultati permettono di concludere che nel testicolo di topo dopo la nascita, Nanos3 è un fattore importante nel mantenimento dello stato indifferenziato degli spermatogoni attraverso la regolazione del loro ciclo. Nella seconda parte del lavoro, è stata realizzata un’ analisi, mediante macroarray, dei geni regolati dal trattamento con KL o ATRA negli spermatogoni ottenuti da topi di 7 giorni di età. L’analisi ha evidenziato che il pattern di espressione dei geni che risultano indotti da KL è in accordo con i cambiamenti che intervengono nel ciclo cellulare durante le divisioni cellulari successive degli spermatogoni di tipo A e B. KL induce, infatti, l’espressione dei geni correlati alle fasi iniziali della meiosi negli spermatogoni in differenziamento e regola negativamente l’espressione dei geni tipicamente presenti negli spermatogoni durante la fase mitotica. Inoltre, l’analisi dei dati ottenuti da spermatogoni trattati con acido retinoico, ha confermato che l’ ATRA induce un pattern di espressione genica compatibile con la progressione verso il programma differenziativo della meiosi, suggerendo che l’ATRA e KL, indipendentemente, sono in grado di promuovere l’entrata nella meiosi negli spermatogoni.