Sox2 conditional deletion in germ cells: a potential role in gametogenesis

During mammalian pre-implantation development pluripotent cells are established within the inner cell mass (ICM). These pluripotent cells contribute to all the somatic cell lineages and establish the germ line, the only cell lineage to be transmitted to the next generation. The molecular mechanisms leading to germ cell specification have not been elucidated, but some genes that are critical for pluripotent cells and during pre-implantation development are subsequently restricted to the germ lineage. Among these genes Sox2 has been shown to be specifically expressed in the ICM, in neural stem cells and in primordial germ cells (PGCs). Sox2 deletion is lethal very early during embryogenesis, and null blastocysts do not develop correctly at implantation. To understand the timing of Sox2 expression in germ cells, we first performed β-galactosidase histochemistry on whole-mount embryos, including gonads, at various developmental stages by using Sox2-βgeo knock-in mice. By Northern blot analysis we found Sox2 expression in postnatal spermatogonia and testes, from 1 dpp up to the puberal age. Since it has been shown, by RNA wholemount in situ hybridization, that Sox2 is expressed in PGCs, we performed an immunohistochemistry (IHC) on testis sections. Interestingly, we found Sox2 expression in 13 dpc pro-spermatogonia as well as in spermatogonial stem cells. This suggests that, Sox2 expression in male germline is associated to the stem cell compartment. In female germ cells, we found positivity in growing oocytes and in 1 dpc fertilized egg by immunofluorescence (IF). We also found that Sox2 is expressed in the human embryo in the developing neural tube, neural crest cells and in scattered cells, between the dorsal mesentery and the mesonephroi, which were positive for Oct4 and suggestive of PGCs. Sox2 is also expressed in fetal lung and after, in lung and thyroid cancers of human adult. To specifically target Sox2 deletion in the germ line, Sox2-lox mice were first cross bred to Sox2- βgeo/TNAP-Cre mice, to generate Sox2lox/Sox2βgeo/TNAP-Cre animals. Sox2 excision in the gonads was verified by PCR, western blot and IHC. Deleted female and male 12 dpc embryos were then sacrificed and gonads analysed. By PCR genotyping the gonads deletion was confirmed. However, immunostaining of the deleted gonads showed Sox2 expression, suggesting probably, that Cremediated excision of Sox2 was only partial. When a deleted male was mated to wt female we observed normal litter size, but without the Sox2null allele, suggesting a potential role for Sox2 in male gametes maturation. When a deleted adult female was mated to a wt male, a strong reduction of the litter size was observed. Analysis of 2 dpc embryos, obtained from this intercross, outgrown in vitro for 2.5 days showed that they did not develop beyond 2/4-cell stage and were negative, by IF, to Sox2 and Oct4 staining. This finding suggests that Sox2 could also be important, in female gametes, for the early embryonic development.

Durante lo sviluppo embrionale del mammifero, prima del suo impianto, si vengono a formare nella massa cellulare interna (ICM) cellule pluripotenti. Queste ultime produrranno nell’adulto tutte le linee cellulari somatiche nonché le cellule germinali, l’unica linea di cellule ad essere trasmessa alla generazione successiva. I meccanismi molecolari responsabili della formazione delle cellule germinali non sono ancora stati chiariti del tutto, ma alcuni geni critici per il mantenimento delle cellule pluripotenti e durante lo sviluppo precoce embrionale sono successivamente ristretti alla linea germinale. Fra questi geni Sox2 è stato visto essere espresso in maniera specifica nella ICM, nelle cellule staminali neurali e nelle cellule primordiali germinali (PGCs). Inoltre la delezione di Sox2 risulta letale già durante l’embriogenesi precoce, tanto che blastocisti prive di Sox2 non si sviluppano correttamente fino al loro impianto. Per seguire l’espressione di Sox2 nelle cellule germinali, abbiamo innanzitutto effettuato un saggio istochimico per la β−galattosidasi su embrioni totali e sulle gonadi, a varie età di sviluppo, impiegando topi knock-in Sox2-βgeo. Mediante analisi per Northern blot, abbiamo scoperto che Sox2 è espresso negli spermatogoni e nei testicoli post-natali da 1 dpp fino alla pubertà. Dato che è stata dimostrata l’espressione di Sox2 nelle PGCs per ibridazione in situ di RNA totale, abbiamo deciso di effettuare un’analisi immunoistochimica (IHC) su sezioni di testicolo. Abbiamo così trovato un’interessante espressione di Sox2 sia nei pro-spermatogoni a 13 dpc che nelle cellule spermatogoniali staminali. Questo risultato suggerisce pertanto che l’espressione di Sox2 nella linea germinale maschile è associata al compartimento staminale. Quando invece abbiamo analizzato, per immunofluorescenza (IF), l’espressione proteica di Sox2 nelle cellule germinali femminili, la positività è stata trovata negli ovociti in accrescimento e nell’ uovo fecondato ad 1 dpc. Abbiamo anche osservato l’espressione di Sox2 nell’embrione umano a livello del tubo neurale in via di sviluppo, nelle cellule delle creste neurali, ed in cellule sparse tra il mesentere dorsale ed il mesonefro, positive ad Oct4, e quindi possibili PGCs. Sox2 nell’uomo è espresso anche nel polmone fetale e in tumori polmonari e tiroidei da pazienti adulti. Per inidirizzare in maniera specifica la delezione di Sox2 nella linea germinale, abbiamo dapprima incrociato topi Sox2-lox con topi Sox2-βgeo/TNAP-Cre, per generare animali Sox2lox/Sox2βgeo/TNAP-Cre. La corretta excisione di Sox2 nelle gonadi è stata verificata mediante PCR, western blot ed immunoistochimica. Abbiamo così sacrificato embrioni maschili e femminili deleti di 12 dpc e ne abbiamo analizzato le gonadi: la delezione condizionale di Sox2 è stata confermata per PCR. Tuttavia, l’analisi istochimica delle gonadi delete mostrava ancora espressione di Sox2, suggerendo probabilmente, che l’excisione di Sox2 mediata da Cre era stata solo parziale. Quando un maschio deleto è stato accoppiato con una femmina wt abbiamo ottenuto una progenie normale, mancante però dell’allele Sox2null, suggerendo un potenziale ruolo per Sox2 nello sviluppo dei gameti maschili. Quando invece una femmina adulta deleta è stata accoppiata con un maschio wt, abbiamo osservato una marcata riduzione della progenie. L’analisi di embrioni a 2 dpc, ottenuti da quest’ultimo incrocio, cresciuti in vitro per 2.5 giorni ha mostrato un loro arresto nello sviluppo tra 2 e 4 cellule, risultando per IF negativi sia a Sox2 che ad Oct4. Questo risultato suggerisce che Sox2 possa anche essere importante nei gameti femminili per lo sviluppo embrionale precoce.