Mitochondrial bioenergetics of sperm and pbmcs in response to environmental exposures: novel biomarkers for assessing male reproductive health and environmental damage

Pollutants represent the most significant threats to the health of all living species. The World Health Organization (WHO) estimates that approximately a quarter of human diseases are caused by prolonged exposure to environmental pollutants, in conjunction with lifestyle factors as reported in the European Code against Cancer. The mechanisms by which environmental agents damage human health are largely unknown. However, an imbalance of radical oxygen species (ROS) and associated oxidative stress may be the common factor through which pollutants alter biomolecular cellular structures such as proteins, lipids, and DNA strands. Indeed, the imbalance of antioxidant defenses and detoxification processes provides a logical explanation for the onset of oxidative stress diseases in humans, increasing the organism's susceptibility to toxicity, including pollutants. The mitochondrion plays a central role in maintaining the intracellular redox state, as it serves as the main cellular energy source by producing ATP. It also carries out various central processes for cellular functions, including signaling pathways for calcium and programmed cell death. However, mitochondria adapt to stress to support homeostasis, and many diseases result from mitochondrial alterations. Mitochondria have recently been recognized as a primary target of various pollutants. Mitochondrial DNA (mtDNA), in particular, is more sensitive than nuclear DNA. In vivo and in vitro studies indicate that exposure to pollutants leads to the alteration of respiratory mitochondrial function, a reduction in mtDNA copy number (mtDNA- 4 CN), and changes in mtDNA methylation in a specific region called the D-loop, which regulates both transcription and replication of mtDNA. Considering the impact of pollutants on health from the perspective of safeguarding public health and prevention, it is crucial to utilize early health biomarkers. In this regard, the male reproductive system is particularly sensitive to pollutants and an increasing number of studies indicate the particularly alarming decline in sperm quality that has been observed for decades, not only in Western countries but now on a global level, with a particular emphasis in areas where pollution rates are higher. Recent studies from the EcoFoodFertility research project (www.ecofoodfertility.it) highlight the male reproductive system as a "Sentinel System Organ" and human semen as an early and sensitive environmental and health marker. In this context, the study of spermatozoa energy metabolism, in which mitochondria play a crucial role, represents a novel and intriguing approach towards understanding the biochemical mechanisms underlying male fertility. Spermatozoa, in particular, are energy-intensive cells and highly susceptible to the prooxidant effects of environmental pollutants due to the limited volume of cytoplasmic space and lower antioxidant defense. This thesis work aimed to evaluate the associations between mitochondrial bioenergetics of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and sperms, mtDNA copy number of sperms,histone/protamine ratio, oxidative sperm DNA damage classification, hydroperoxide concentration, antioxidant defenses and PARP expression in blood plasma in response to environmental exposures using a combination of in vitro and human studies. For the human studies, blood and semen samples from 23 healthy young males, residing in 5 areas with different environmental exposures of Campania Region (Southern Italy) and recruited during the EcoFoodFertility research project,have been analyzed to compare any differences in behavior between sperm and leukocyte mitochondria. The results obtained from the experiments performed on human semen and blood serum on 23 healthy males recruited in November 2022 (aged 18 years, no smokers, no habitual alcohol drinkers, with BMI < 25) living in a polluted area (14 in Land of Fires, LF) and no polluted area (9 in Valley of Sele river, VSL) of the Campania Region in the frame of the EcoFoodFertility Project showed no differences between the two groups in classical sperm parameters, but differences in PBMC bioenergetics, sperm mtDNA-CN, histone/protamine ratio, oxidative sperm DNA damage, hydroperoxide concentration, antioxidant defenses and PARP expression in blood plasma. The results show that mitochondrial function is higher in the spermatozoa of the LF group than to VSL, thiscan be elucidated by a rise in the quantity of mitochondria, as indirectly indicated by an elevation in the mtDNA replication count in the LF category in relation to the VSL. Furthermore, this bioenergetic behavior is much more pronounced in sperm mitochondria compared to that of PBMCs Other results show a lower reserve capacity (ability to respond to increased demand energy following an insult) in LF than VSL group, highlighting that sperm cells are more sensitive to stress than PBMCs. A difference in the protamine/histones ratio was observed between the two areas, where a canonical protamine/histone ratio was found in most VSL subjects, but only in one third of LF subjects. In addition, most Sperm Nuclear Basic 6 Proteins (SNBPs) of LF subjects proved unable to protect DNA from oxidative damage, unlike VSL subjects. Individuals were classified into three categories on the basis of measurements of hydroperoxides and antioxidant levels on blood plasma. VSL samples were defined “Control” due to the absence of oxidative stress, while LF were divided into two different groups. The first including individuals with “Low/Intermediate” oxidative stress and the second those with “High/Very high” oxidative stress. In all LF individuals, PARP 1 was expressed, but only in samples with high/very high oxidative stress this protein was also automodified.In conclusion, these results contribute not only to providing further knowledge on the interaction between the environment, bioenergetics, and genomics of sperm mitochondria, but also providing novel earlier reproductive biomarkers that, along with other biomarkers explored in the study, represent a set of biomolecular analyses that go beyond the analysis of simple spermiogram to assess the earliest signs of environmental damage beyond reproductive health itself. Overall, this study conducted on two small groups in two areas with different environmental pressure, but homogeneous in terms of age, lifestyle, and body mass index, further strengthens the previous results of the EcoFoodFertility project, indicating human semen as an early and reliable environmental and health marker. It can be considered an effective source of biomarkers for assessing exposure to biologically active substances and providing valuable information for innovative prevention and health surveillance programs, especially in highly polluted areas. Furthermore, the study provides further evidence of a higher "health" risk for populations residing in areas with high environmental pollution and the need for 7 increasingly urgent actions for the environmental requalification of these territories.The writing of a manuscript for the publication of these results in an indexed journal is currently underway.

I contaminanti rappresentano le minacce più significative per la salute di tutte le specie viventi. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che circa un quarto delle malattie umane sia causato dall'esposizione prolungata a inquinanti ambientali, in combinazione con fattori di stile di vita come riportato nel Codice Europeo contro il Cancro. I meccanismi attraverso i quali gli agenti ambientali danneggiano la salute umana sono in gran parte sconosciuti. Tuttavia, un’eccessiva produzione di specie radicali dell’ossigeno (ROS) induce uno stress ossidativo e questo rappresenta il denominatore comune attraverso il quale gli inquinanti alterano le strutture biomolecolari cellulari come proteine, lipidi e filamenti di DNA. Infatti, lo squilibrio delle difese antiossidanti e dei processi di detossificazione fornisce una spiegazione logica all'insorgenza di malattie da stress ossidativo nell'uomo, aumentando la suscettibilità dell'organismo agli effetti tossici degli inquinanti. Il mitocondrio svolge un ruolo centrale nel mantenere lo stato redox intracellulare, poiché funge da principale fonte di energia cellulare producendo ATP. Svolge anche vari processi centrali per le funzioni cellulari, incluse le vie di segnalazione per il calcio e la morte cellulare programmata. Tuttavia, i mitocondri si adattano allo stress per sostenere l'omeostasi, e molte malattie derivano da alterazioni mitocondriali. 8 I mitocondri sono stati recentemente riconosciuti come un bersaglio primario di vari inquinanti. Il DNA mitocondriale (mtDNA), in particolare, è più sensibile rispetto al DNA nucleare. Studi in vivo e in vitro indicano che l'esposizione agli inquinanti porta all'alterazione della funzione respiratoria mitocondriale, a una riduzione del numero di copie di mtDNA (mtDNA-CN) e a cambiamenti nella metilazione del mtDNA in una regione specifica chiamata D-loop, che regola sia la trascrizione che la replicazione del mtDNA. Considerando l'impatto degli inquinanti sulla salute ed in ottica di salvaguardia della salute pubblica e di prevenzione, è cruciale conoscere i biomarcatori precoci di danno alla salute. In questo contesto, il sistema riproduttivo maschile è particolarmente sensibile agli inquinanti e un numero crescente di studi indica un preoccupante declino nella qualità dello sperma che si osserva da decenni, non solo nei paesi occidentali ma ora anche a livello globale, in particolare nelle aree dove i tassi di inquinamento sono più alti. Recenti studi del progetto di ricerca EcoFoodFertility (www.ecofoodfertility.it) evidenziano come il sistema riproduttivo maschile possa rappresentare un "Organo Sentinella" e il seme umano come un marcatore ambientale e di salute precoce e sensibile. In questo contesto, lo studio del metabolismo energetico degli spermatozoi, in cui i mitocondri svolgono un ruolo cruciale, rappresenta un approccio nuovo ed importante per comprendere i meccanismi biochimici alla base della fertilità maschile. Gli spermatozoi, in particolare, sono cellule ad alta energia e altamente suscettibili agli effetti proossidanti degli inquinanti ambientali a causa del limitato volume di spazio citoplasmatico e di minori difese antiossidanti. 9 La tesi ha avuto lo scopo di valutare le associazioni tra bioenergetica mitocondriale delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e gli spermatozoi, il numero di copie del mtDNA degli spermatozoi, il rapporto istoni/protammine, la classificazione dei danni ossidativi al DNA degli spermatozoi, la concentrazione di idroperossidi, le difese antiossidanti e l'espressione di PARP nel plasma ematico in risposta alle esposizioni ambientali utilizzando una combinazione di studi in vitro e sull’uomo. Per gli studi umani, campioni di sangue e sperma provenienti da 23 giovani maschi sani, residenti in aree con diversa esposizione ambientale (area ad alto impatto ambientale verso area a basso impatto ambientale) della regione Campania (Italia meridionale) e reclutati durante il progetto di ricerca EcoFoodFertility, sono stati analizzati per confrontare eventuali differenze nel comportamento tra i mitocondri degli spermatozoi e quelli delle PBMC oltre ad altre valutazioni come prima descritto. I risultati ottenuti dagli esperimenti eseguiti su sperma umano e siero del sangue su 23 maschi sani reclutati a novembre 2022 (età 18 anni, non fumatori, non bevitori abituali di alcol, con BMI < 25) residenti in un'area inquinata (14 nella Terra dei Fuochi, LF) e in un'area non inquinata (9 nella Valle del fiume Sele, VSL) della regione Campania, nel contesto del progetto EcoFoodFertility, non hanno mostrato differenze tra i due gruppi nei parametri classici dello sperma, ma differenze nella bioenergetica delle PBMC, degli spermatozoi, nel numero di copie del mtDNA degli spermatozoi, nel rapporto istoni/protammine, nei danni ossidativi al DNA degli spermatozoi, nella concentrazione di idroperossidi, nelle difese antiossidanti e nell'espressione di PARP nel plasma ematico. I risultati mostrano che 10 la funzione mitocondriale è più elevata negli spermatozoi del gruppo LF rispetto a VSL, ciò può essere spiegato da un aumento della quantità di mitocondri, come indicato indirettamente da un aumento di copie del mtDNA nel gruppo LF rispetto a quello VSL. Inoltre, questo comportamento bioenergetico è molto più evidente nei mitocondri degli spermatozoi rispetto a quelli delle PBMC. Altri risultati mostrano una capacità di riserva inferiore (capacità di rispondere a una maggiore domanda energetica in seguito a un insulto) nel gruppo LF rispetto al gruppo VSL, evidenziando che le cellule spermatiche sono più sensibili allo stress rispetto alle PBMC. Una forte differenza nel rapporto istoni/protammine è stata osservata tra le due aree, dove è stato trovato un rapporto istoni/protammine canonico nella maggior parte dei soggetti VSL, ma solo in un terzo dei soggetti LF. Inoltre, la maggior parte delle proteine basiche spermatiche (Sperm Nuclear Basic Proteins, SNBP) dei soggetti LF si sono dimostrati incapaci di proteggere il DNA dai danni ossidativi, a differenza dei soggetti VSL. Inoltre, sulla base delle misurazioni degli idroperossidi e dei livelli di antiossidanti nel plasma ematico, i soggetti sono stati classificati in tre categorie. I campioni VSL sono stati definiti "Controllo" per l'assenza di stress ossidativo, mentre i campioni LF sono stati divisi in due gruppi diversi. Il primo includeva individui con stress ossidativo "Basso/Intermedio" e il secondo quelli con stress ossidativo "Alto/Molto alto". In tutti i soggetti LF, la PARP 1 era espressa, ma solo nei campioni con stress ossidativo alto/molto alto, dove questa proteina è risultata automodificata. In conclusione, questi risultati contribuiscono non solo a fornire ulteriori conoscenze sull'interazione tra ambiente, bioenergetica, genomica dei mitocondri degli 11 spermatozoi, ma anche a fornire nuovi biomarcatori riproduttivi precoci che, insieme ad altri biomarcatori esplorati nello studio, rappresentano un insieme di analisi biomolecolari che vanno oltre l'analisi del semplice spermiogramma per valutare i primi segni di danno ambientale che vanno anche oltre la salute riproduttiva stessa. In generale, questo studio condotto su due piccoli gruppi in due aree con diverse pressioni ambientali, ma omogenee per età, stile di vita e indice di massa corporea, rafforza ulteriormente i risultati precedenti del progetto EcoFoodFertility, indicando il seme umano come un marcatore ambientale e di salute precoce ed affidabile. Infatti, il seme umano può essere considerato una fonte importante di biomarcatori per valutare l'esposizione a sostanze biologicamente attive e fornire informazioni preziose per favorire programmi innovativi di prevenzione e sorveglianza della sanitaria, specialmente per popolazioni che vivono in aree altamente inquinate. Inoltre, lo studio fornisce ulteriori prove di rischio "salute" per le popolazioni che risiedono in aree con elevato inquinamento ambientale, dove è sempre più urgente la necessità di avviare azioni di riqualificazione ambientale. I risultati di questa tesi sono attualmente oggetto di un articolo che è in fase di scrittura per la sottomissione su rivista internazionale indicizzata