I retroelementi nella tumorigenesi: ruoli distinti di LINE-1 ed HERV-K nella progressione tumorale

Retroelements are sequences highly repeated present in all eucaryotic genomes and they encode for a RT that is expressed at high levels in cells and tissue types characterized by a high proliferative potential and a low degree of differentiation (e.g. embryonic tissues and tumor cells), whereas low RT levels are generally found in terminally differentiated, non pathological tissue. Previous studies have showed that inhibition of endogenous RT, using pharmacological inhibitors, (nevirapine and efavirenz) reduces proliferation and promotes differentiation of human tumorigenic cell lines and strongly antagonizes tumor progression in murine models (Mangiacasaele et al., 2003 Sciamanna et al., 2005; reviewed by Sinibaldi-Vallebona et al., 2006). In this work I have showed that the RT inhibitors, in contrast to what observed in tumorigenic cells, does not exert any effect on normal cells. In addition, I using a RNA interference approach (RNAi), I assessed the different roles of two retroelements LINE-1 and HERV-K in tumorigenesis and tumor progression. Using retroviral vectors, I produced two cell lines, derived from A375 melanoma cells, stably interfered for the expression of these elements. The cells in which LINE-1 expression was interfered exhibit a reduced proliferation and significant changes in morphology, suggestive of that a differentiation was activated. Moreover, these cells showed a reduced tumorigenecity when injected in nude mice. Instead, cells in which HERV-K expression was interfered the rate of proliferation and differentiation remain unchanged compared to the parental A375 cells. However, in vivo essays their tumorigenic potential was found to be reduced. Finally, aiming at the development of a novel gene therapy approach for cancer differentiation I developed an adenoviral delivery system which offers several advantages compared to retroviruses, most important the fact that adenodelivered sequences remain as non-integrated episomes and the infection can be repeated several times to improve the efficiency of infection.

I retroelementi sono sequenze altamente ripetute disperse nel genoma, che codificano per una Trascrittasi Inversa (RT). Cellule e tessuti caratterizzati da una elevata capacità di proliferazione e un basso grado di differenziamento (come cellule tumorali o embrionali) esprimono alti livelli di RT che al contrario è scarsamente espressa in tessuti terminalmente differenziati. E’ noto da precedenti studi condotti nel nostro laboratorio che il trattamento di diverse linee cellulari tumorali con due inibitori non nucleosidici della RT, la nevirapina ed l’efavirenz, induce una riduzione della proliferazione e della tumorigenicità in in vitro e d in vivo e ne promuove il differenziamento (Mangiacasale et al., 2003; Sciamanna et al., 2005; per una review Sinibaldi- Vallebona et al., 2006). In questo lavoro ho dimostrato che gli inibitori della RT, inibiscono la proliferazione solo delle cellule tumorali mentre non hanno alcun effetto significativo sulle cellule normali. Inoltre, utilizzando la tecnica dellRNA interference (RNAi) ho identificato due famiglie di retroelementi, LINE-1 e HERV-K, che hanno ruoli diversi nella tumorigenesi. Infettando cellule di melanoma A375 con vettori retrovirali adeguatamente ingegnerizzati allo scopo, ho prodotto due linee cellulari in cui l’espressione di questi due retroelementi sia stabilmente interferita. Le cellule interferite per il LINE-1 hanno una ridotta proliferazione, una morfologia alterata ed un’espressione alterata di alcuni geni che regolano la proliferazione e il differenziamento. Al contrario, le cellule A375 interferite per HERV-K non mostrano nessun cambiamento in vitro. A differenza di quanto osservato in vitro, entrambe le linee cellulari inoculate in topi nudi atimici hanno una ridotta tumorigenicità rispetto alle cellule della linea parentale. Infine, allo scopo di sviluppare una possibile terapia genica differenziativa dei tumori, ho sviluppato un sistema di vettori adenovirali in sostituzione di quelli retro virali; i primi infatti offrono una serie di vantaggi rispetto ai vettori retrovirali, primo fra tutti il fatto che queste le sequenze rimangono in forma episomale consentendo quindi di ripetere l’infezione diverse volte allo scopo di migliorarne l’efficienza.