Proteolytic degradation of basement memnbrane influences the cell behaviour during important processes, such as inflammations, tumorigenesis, angiogenesis and allergic diseases. In this study, we have investigated the action of gelatinase A (MMP-2) and B (MMP-9) on collagen IV, the major constituent of the basement membrane. We have compared quantitatively their actions on the soluble forms of collagen IV extracted with or without pepsin (from human placenta and from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murine sarcoma, respectively). The catalytic efficiency of MMP-2, and also MMP-9, is dramatically reduced in the case of the EHS murine sarcoma with respect to the human placenta, probably due to the much tighter packing of the network which renders very slow the speed of the rate-limiting step. We have also enquired on the role of MMP-2 domains in processing collagen IV. The removal of the hemopexin-like domain, using only the catalytic domain of MMP-2, has only a limited effect on the catalytic efficiency toward collagen IV, indicating that the missing domain has not a great relevance for the overall mechanism. Instead, the addition of the isolated collagen binding domain, corresponding to the fibronectin-like domain of whole MMP-2, greatly inhibits the cleavage process, demonstrating that MMP-2 interacts with collagen type IV preferentially through its fibronectin-like domain. Finally, we have investigated the effect of MMP-2 proteolytic activity ex vivo. MMP-2 action negatively affects the neutrophil cells migration across type IV coated membranes and this is likely related to the production of lower molecular weight fragments which impair the cellular migration.However, for both types of collagen IV the enzymatic processing by MMP-9 is dramatically enhanced in the presence of the Collagen Binding Domain of Gelatinase A (CBD). This effect, clearly indicates that the fibronectin-like domain of MMP-2 and MMP-9 bind to topologically distinct sites on type IV collagen, bringing about a conformational change of the collagen IV molecule. This allows the two enzymes to cooperate with each other through a ligand-linked mechanism, which does not necessarily require the enzymatic action. Therefore, fibronectin-like domains not only increase the affinity between enzyme and substrate to enhance the catalysis, they also act as allosteric third party elements in the MMP action. This synergistic action between MMP-2 and MMP-9 on collagen IV has been tested also with an ex vivo eperiment. The MMP-2 without the catalytic domain, the rCBD and the pro-MMP-2 increase the neutrophil cells migration across collagen IV coated membranesand this is related to the growth of the catalytic activity of MMP-9.

In condizioni patologiche le gelatinasi o meglio la MMP-2 e la MMP-9 vengono espresse dalle cellule in quantità più elevate rispetto alle normali condizioni fisiologiche. Ne sono un esempio i processi infiammatori e la progressione tumorale, dove queste endopeptidasi Ca+2 e Zn+2 dipendenti sono attivamente coinvolte nel processamento delle membrane basali cellulari; infatti la loro azione permette alle cellule tumorali la loro progressione all’interno di nuovi tessuti, dando origine alla formazione di metastasi. Le gelatinasi influenzano la progressione tumorale in quanto intervengono in un processo che prende il nome di “angiogenic switch”, che consiste nella formazione di una nuova vascolarizzazione in grado di alimentare le cellule in attiva proliferazione. L’ ”angiogenic switch” inizia con la degradazione da parte delle gelatinasi del collagene IV, componente fondamentale della membrana basale vascolare. Esso, una volta processato, libera fattori (quali il VEGF) che stimolano le cellule endoteliali a migrare all’interno di una matrice provvisoria dove si formeranno i nuovi vasi sanguigni. Se da un lato le gelatinasi aumentano l’attività proliferativa delle cellule tumorali, dall’altra sono in grado di inibirla. Sembra infatti che la MMP-2, degradando il collagene di tipo IV, produca dei frammenti con attività anti-angiogenica in grado di bloccare la proliferazione tumorale. Ai fini di una miglior comprensione del ruolo delle Gelatinasi durante la progressione tumorale, abbiamo analizzato l’efficienza delle due metalloproteinasi verso il collagene di tipo IV; e nel caso della MMP-2 abbiamo caratterizzato il ruolo dei suoi diversi domini verso questo substrato naturale. Inoltre è stata effettuata una analisi basata sulla capacità dei neutrofili di migrare attraverso una membrana ricoperta di collagene di tipo IV in presenza di (i) una quantità esogena crescente di MMP-2 (ii) frammenti di arrestina derivanti dal processamento della catene  del collagene IV, (iii) MMP-2 mutata, ossia priva del suo dominio catalitico, (iv) del dominio ricombinante fibronectinico della MMP-2 o rCBD e (v) la MMP-2 inattiva o pro-MMP-2.Per finire abbiamo studiato l’esistenza di una possibile interazione tra le due gelatinasi nel processare il collagene di tipo IV sia in vitro che in condizioni ex vivo.I nostri risultati dimostrano come entrambe le gelatinasi processano il componente fondamentale delle membrane basale vascolare in condizioni fisiologiche, 37°C e pH 7,2. Inoltre l’MMP-2 interagisce con la MMP-9 aumentandone l’efficienza di processamento verso il collagene di tipo IV, per effetto di un controllo allosterico dovuto al semplice legame dell’enzima con il substrato. Quando la MMP-2 si lega al collagene IV per opera del suo dominio fibronectinico (CBD) , la MMP-9 processa il substrato con maggiore efficienza rispetto all’ azione quando è prsente da sola. Il fenomeno varia a seconda della concentrazione della MMP-2 che possiede due siti di legame per questo tipo di collagene: uno ad alta affinità ed un secondo sito con una scarsa affinità di legame. A bassa concentrazione di MMP-2 viene legato solo il sito del substrato per cui l’enzima posside una maggior affinità e di conseguenza la MMP-9 legandosi allo stesso substrato lo processa con maggior efficienza. Al contrario, ad alte concentrazioni di MMP-2, l’enzima si lega ad ambedue i siti di attacco che possiede nel collagene IV diminuendo la capacità della MMP-9 di processarlo, a causa di una probabile sovrapposizione del sito di attacco dei due enzimi.L’attività sinergica delle due gelatinasi viene riscontrata anche ex vivo, ossia mediante esperimenti di migrazione cellulare attraverso un coating di collagene IV. Le cellule utilizzate sono neutrofili, cellule in grado di esprimere vari enzimi proteolitici tra cui metalloproteinasi come la MMP-8 e la MMP-9 e proteasi a serina come l’elastasi del neutrofili. Risultano invece non produrre livelli apprezzabili di MMP-2, come dimostrato dalle zimografie delle Figure 10 e 11. I neutrofili, grazie alla MMP-9, sono quindi in grado di oltrepassare la barriera di collagene IV, che viene processato con maggior attività in presenza di quantità esogene di MMP-2 priva del dominio catalitico o in aggiunta del suo dominio di legame al substrato, il dominio ricombinante rCBD.

Monaco, S. (2007). Basement membrane and cellular migration: role of Gelatinases (MMP-2, MMP-9) on proteolysis of type IV collagen.

Basement membrane and cellular migration: role of Gelatinases (MMP-2, MMP-9) on proteolysis of type IV collagen

MONACO, SUSANNA
2007-12-21

Abstract

In condizioni patologiche le gelatinasi o meglio la MMP-2 e la MMP-9 vengono espresse dalle cellule in quantità più elevate rispetto alle normali condizioni fisiologiche. Ne sono un esempio i processi infiammatori e la progressione tumorale, dove queste endopeptidasi Ca+2 e Zn+2 dipendenti sono attivamente coinvolte nel processamento delle membrane basali cellulari; infatti la loro azione permette alle cellule tumorali la loro progressione all’interno di nuovi tessuti, dando origine alla formazione di metastasi. Le gelatinasi influenzano la progressione tumorale in quanto intervengono in un processo che prende il nome di “angiogenic switch”, che consiste nella formazione di una nuova vascolarizzazione in grado di alimentare le cellule in attiva proliferazione. L’ ”angiogenic switch” inizia con la degradazione da parte delle gelatinasi del collagene IV, componente fondamentale della membrana basale vascolare. Esso, una volta processato, libera fattori (quali il VEGF) che stimolano le cellule endoteliali a migrare all’interno di una matrice provvisoria dove si formeranno i nuovi vasi sanguigni. Se da un lato le gelatinasi aumentano l’attività proliferativa delle cellule tumorali, dall’altra sono in grado di inibirla. Sembra infatti che la MMP-2, degradando il collagene di tipo IV, produca dei frammenti con attività anti-angiogenica in grado di bloccare la proliferazione tumorale. Ai fini di una miglior comprensione del ruolo delle Gelatinasi durante la progressione tumorale, abbiamo analizzato l’efficienza delle due metalloproteinasi verso il collagene di tipo IV; e nel caso della MMP-2 abbiamo caratterizzato il ruolo dei suoi diversi domini verso questo substrato naturale. Inoltre è stata effettuata una analisi basata sulla capacità dei neutrofili di migrare attraverso una membrana ricoperta di collagene di tipo IV in presenza di (i) una quantità esogena crescente di MMP-2 (ii) frammenti di arrestina derivanti dal processamento della catene  del collagene IV, (iii) MMP-2 mutata, ossia priva del suo dominio catalitico, (iv) del dominio ricombinante fibronectinico della MMP-2 o rCBD e (v) la MMP-2 inattiva o pro-MMP-2.Per finire abbiamo studiato l’esistenza di una possibile interazione tra le due gelatinasi nel processare il collagene di tipo IV sia in vitro che in condizioni ex vivo.I nostri risultati dimostrano come entrambe le gelatinasi processano il componente fondamentale delle membrane basale vascolare in condizioni fisiologiche, 37°C e pH 7,2. Inoltre l’MMP-2 interagisce con la MMP-9 aumentandone l’efficienza di processamento verso il collagene di tipo IV, per effetto di un controllo allosterico dovuto al semplice legame dell’enzima con il substrato. Quando la MMP-2 si lega al collagene IV per opera del suo dominio fibronectinico (CBD) , la MMP-9 processa il substrato con maggiore efficienza rispetto all’ azione quando è prsente da sola. Il fenomeno varia a seconda della concentrazione della MMP-2 che possiede due siti di legame per questo tipo di collagene: uno ad alta affinità ed un secondo sito con una scarsa affinità di legame. A bassa concentrazione di MMP-2 viene legato solo il sito del substrato per cui l’enzima posside una maggior affinità e di conseguenza la MMP-9 legandosi allo stesso substrato lo processa con maggior efficienza. Al contrario, ad alte concentrazioni di MMP-2, l’enzima si lega ad ambedue i siti di attacco che possiede nel collagene IV diminuendo la capacità della MMP-9 di processarlo, a causa di una probabile sovrapposizione del sito di attacco dei due enzimi.L’attività sinergica delle due gelatinasi viene riscontrata anche ex vivo, ossia mediante esperimenti di migrazione cellulare attraverso un coating di collagene IV. Le cellule utilizzate sono neutrofili, cellule in grado di esprimere vari enzimi proteolitici tra cui metalloproteinasi come la MMP-8 e la MMP-9 e proteasi a serina come l’elastasi del neutrofili. Risultano invece non produrre livelli apprezzabili di MMP-2, come dimostrato dalle zimografie delle Figure 10 e 11. I neutrofili, grazie alla MMP-9, sono quindi in grado di oltrepassare la barriera di collagene IV, che viene processato con maggior attività in presenza di quantità esogene di MMP-2 priva del dominio catalitico o in aggiunta del suo dominio di legame al substrato, il dominio ricombinante rCBD.
A.A. 2007/2008
Biologia molecolare e scienze biomediche
20.
Proteolytic degradation of basement memnbrane influences the cell behaviour during important processes, such as inflammations, tumorigenesis, angiogenesis and allergic diseases. In this study, we have investigated the action of gelatinase A (MMP-2) and B (MMP-9) on collagen IV, the major constituent of the basement membrane. We have compared quantitatively their actions on the soluble forms of collagen IV extracted with or without pepsin (from human placenta and from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murine sarcoma, respectively). The catalytic efficiency of MMP-2, and also MMP-9, is dramatically reduced in the case of the EHS murine sarcoma with respect to the human placenta, probably due to the much tighter packing of the network which renders very slow the speed of the rate-limiting step. We have also enquired on the role of MMP-2 domains in processing collagen IV. The removal of the hemopexin-like domain, using only the catalytic domain of MMP-2, has only a limited effect on the catalytic efficiency toward collagen IV, indicating that the missing domain has not a great relevance for the overall mechanism. Instead, the addition of the isolated collagen binding domain, corresponding to the fibronectin-like domain of whole MMP-2, greatly inhibits the cleavage process, demonstrating that MMP-2 interacts with collagen type IV preferentially through its fibronectin-like domain. Finally, we have investigated the effect of MMP-2 proteolytic activity ex vivo. MMP-2 action negatively affects the neutrophil cells migration across type IV coated membranes and this is likely related to the production of lower molecular weight fragments which impair the cellular migration.However, for both types of collagen IV the enzymatic processing by MMP-9 is dramatically enhanced in the presence of the Collagen Binding Domain of Gelatinase A (CBD). This effect, clearly indicates that the fibronectin-like domain of MMP-2 and MMP-9 bind to topologically distinct sites on type IV collagen, bringing about a conformational change of the collagen IV molecule. This allows the two enzymes to cooperate with each other through a ligand-linked mechanism, which does not necessarily require the enzymatic action. Therefore, fibronectin-like domains not only increase the affinity between enzyme and substrate to enhance the catalysis, they also act as allosteric third party elements in the MMP action. This synergistic action between MMP-2 and MMP-9 on collagen IV has been tested also with an ex vivo eperiment. The MMP-2 without the catalytic domain, the rCBD and the pro-MMP-2 increase the neutrophil cells migration across collagen IV coated membranesand this is related to the growth of the catalytic activity of MMP-9.
matrixmetalloproteinases; basement membrane; collagen IV; angiogenesis; extracellular matrix
Settore BIO/11
eng
Tesi di dottorato
Monaco, S. (2007). Basement membrane and cellular migration: role of Gelatinases (MMP-2, MMP-9) on proteolysis of type IV collagen.
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