A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS: a role for the Fragile X mental retardation protein

FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) is an RNA binding protein highly expressed in the brain. Absence or mutation of FMRP leads to the Fragile X syndrome, an X-linked dominant disorder and the most frequent cause of inherited mental retardation (with an incidence of 1:4000 male and 1:6000 female). Using the mouse model of Fragile X syndrome (the FMR1 knock-out mouse), I showed that FMRP is a repressor of translation in vivo and regulates translation of specific dendritic and synaptic mRNAs, including those encoding the cytoskeletal proteins Arc/Arg3.1 and MAP1B and the kinase alpha-CaMKII. Interestingly, FMRP associates not only with these target mRNAs, but also with the dendritic, non-translatable small RNA BC1. Blocking of BC1 inhibits the interaction of FMRP with its target mRNAs. Furthermore, BC1 binds directly to FMRP and can also associate, in the absence of any protein, with the mRNAs regulated by FMRP. This suggests a mechanism where the specificity of FMRP translational repression is defined through base-pairing interactions of the associated BC1 with the mRNAs by linking the regulated mRNAs and FMRP. Thus, when FMRP is not present, loss of translational repression of specific mRNAs at synapses could result in synaptic dysfunction phenotype of Fragile X patients. A fine analysis of the BC1-FMRP interaction by EMSA experiments have pointed out that the N-terminal domain of FMRP binds directly and specifically to the BC1 RNA (Kdapp = 260 nM). Interestingly, the N-terminus of FMRP contains no previously identified motifs for specific RNA recognition, thus constitutes a new RNA binding motif to all intents and purposes. We further demonstrate that FMRP recognition involves the 5' stem-loop of BC1, a region which exhibits complementarity to several FMRP target mRNAs. These results demonstrate that the N-terminus contains a new motif capable of specific RNA binding and suggest that this region of FMRP may be involved in formation and/or stabilization of the BC1-mRNA duplex. Finally, also the human analogue of BC1 RNA, named BC200, is part of hFMRP complex and is able to bind directly and specifically to human FMRP (Kdapp = 360 nM) via the N-terminal domain, strengthening the idea that the two BC RNAs have the same functional significance in neuronal cells contributing to higher level of regulation of key biological processes like the FMRP-dependent local regulation of translation at synapses.

La proteina FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) codificata dal gene FMR1 è una proteina che lega gli RNA, altamente espressa nel cervello e nelle gonadi. L’assenza di FMRP porta alla sindrome dell’X Fragile, una malattia dominante legata all’X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario. Oltre al ritardo mentale la sindrome è anche caratterizzata da macroorchidismo nei maschi in età post-pubertale, dismorfie del volto, anomalie del tessuto connettivo e, dal punto di vista comportamentale, anche da iperattività e comportamento simil-autistico. Nella maggior parte dei casi (99%) l’assenza di FMRP è causata dall’espansione di una tripletta CGG polimorfica posta nella regione 5’UTR del gene FMR1. L’espansione oltre le 200 volte di questa tripletta (condizione detta di “mutazione piena” o “full mutation”) porta all’iper-metilazione della isole CG a monte del promotore con successivo silenziamento trascrizionale del gene FMR1 e assenza della proteina FMRP (per una recente review vedi Zalfa and Bagni, 2004). FMRP è in grado di legare il 4% degli mRNAs neuronali e nel citoplasma neuronale forma un esteso network di interazioni con alcune proteine note e con i suoi mRNAs target formando un grande complesso ribonucleoproteico che è in grado di agire come repressore traduzionale in vitro (Li et al., 2001; Laggerbauer et al., 2001). Questi dati in vitro hanno fatto ipotizzare che FMRP nei neuroni (le cellule che esprimono a più alti livelli la proteina e anche quelle più direttamente colpite dalla sua assenza) svolgesse un importante ruolo nella regolazione di una classe di mRNAs che vengono trasportati dal corpo cellulare dei neuroni fino alle sinapsi e qui localmente tradotti. La sintesi proteica di questi RNA messaggeri alle sinapsi è un meccanismo molecolare molto importante che sta alla base di importanti processi quali la sinaptogenesi (la formazione delle sinapsi) e la plasticità sinaptica e che contribuisce ad orchestrare i processi di apprendimento e di memorizzazione (per una recente review, vedi Wang and Tiedge, 2004). A conferma di questo putativo ruolo di FMRP alle sinapsi, l’unica anomalia morfologica presente nel cervello di pazienti affetti dalla Sindrome dell’X Fragile, come anche nel cervello di topi mancanti del gene FMR1 (FMR1 knockout; Bakker et al., 1994), è la presenza di un alto numero di spine dendritiche molto allungate e sottili con una morfologia tipicamente immatura (Irwin et al., 2001; Nimchinsky et al., 2001). Comunque, fino a pochi anni fa non era ancora noto quale ruolo svolgesse la proteina FMRP dei neuroni del CNS di mammifero e lo specifico meccanismo molecolare attraverso il quale FMRP riconoscesse i propri mRNAs bersaglio. Nella prima fase del mio lavoro di dottorato, utilizzando la tecnica dell’analisi polisomiale su estratti citoplasmatici di cervello di topo, è stata valutata l’efficienza traduzionale di alcuni RNA messaggeri neuronali, importanti per la struttura e la funzione delle sinapsi, in presenza o in assenza di FMRP (cioè in topi wildtype o knockout per il gene FMR1). In questo modo è stato dimostrato che FMRP è un repressore della traduzione anche in vivo e che regola la traduzione di specifici mRNA neuronali (Zalfa et al., 2003). Allo scopo di studiare la funzione di FMRP alle sinapsi, la stessa tecnica è stata applicata a preparazioni di terminali sinaptici purificati (chiamati sinaptoneurosomi; Bagni et al., 2000). Anche alle sinapsi FMRP è un repressore traduzionale la cui azione è più forte e più marcata rispetto al cervello totale. E’ interessante notare che la repressione traduzionale di FMRP agisce specificamente solo su un gruppo di mRNAs dendritici codificanti proteine regolatorie chiave per la sinapsi come Arc/Arg3.1, MAP1B and a-CaMKII. Questo spiega come la mancanza di FMRP può avere effetto sulle funzioni sinaptiche. Anche il meccanismo con cui FMRP inibisce la traduzione dei sui RNA messaggeri bersaglio è completamente nuovo: FMRP è stata trovata far parte di un complesso ribonucleoproteico che contiene un piccolo RNA dendritico, non tradotto chiamato BC1 (Zalfa et al., 2003). Noi abbiamo dimostrato tramite le tecniche dell’immunoprecipitazione e dell’Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), che l’RNA BC1 è in grado di legarsi direttamente e specificamente sia a FMRP che ad alcuni RNA messaggeri regolati traduzionalmente da FMRP. Il blocco di BC1 tramite oligonucleotidi competitori inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Questo suggerisce che la specificità della repressione traduzionale di FMRP sia definita attraverso diretto appaiamento di basi tra l’RNA BC1 e gli RNA regolati da FMRP (Zalfa et al., 2003). In accordo con i nostri dati, recentemente è stato dimostrato che BC1 è un repressore della traduzione in lisati di reticolociti di coniglio che è in grado di inibire la formazione del complesso di preinizio 48S (Wang et al., 2002) associandosi con due proteine chiave per la regolazione traduzionale, la Poly(A) Binding Protein (PABP) ed il fattore di inizio della traduzione eIF4A (Muddashetty et al., 2002; Wang et al., 2002). In questo senso, BC1 potrebbe agire in maniera simile ai micro RNAs (miRNAs) una classe di RNA non-codificanti molto piccoli (22 nt in media) che si appaiano in maniera non perfetta ai loro mRNA target e ne inibiscono la traduzione. A conferma di ciò, recentemente si è visto che FMRP in mammifero (come il suo omologo in Drosophila, dFXR; Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002) può legare micro-RNAs ed interagire con alcune proteine coinvolte nella biogenesi dei micro-RNAs come la esonucleasi DICER ed eIF2C2 (Jin et al., 2004). Durante la seconda fase del mio progetto di Dottorato ho condotto una analisi fine dell’interazione tra l’RNA BC1 e la proteina FMRP, allo scopo di comprendere meglio il significato funzionale di questo complesso nelle cellule neuronali di mammifero. Determinando la costante di dissociazione apparente (Kdapp) in esperimenti EMSA è stato possibile stimare che l’interazione tra BC1 e FMRP rientra in un range di interazioni proteina-RNA mediamente forti (Kdapp ~ 170 nM). Allo scopo di mappare il dominio di FMRP responsabile del legame a BC1 sono stati utilizzati in esperimenti EMSA diversi domini strutturati di FMRP prodotti in E. coli. In particolare ho testato l’intero dominio N-terminale (aa 1-217), due frammenti più piccoli dell’N-terminale (aa 1-134 e aa 1-180), il dominio KH1 (aa 205-280), il dominio KH2 (aa 281-422) e l’intero dominio C-terminale (aa 516-632). Questi esperimenti hanno permesso di evidenziare che l’RNA BC1 si lega fortemente (Kdapp ~ 260 nM) e specificamente alla regione N-terminale di FMRP. Questa regione non contiene nessun dominio canonico di legame all’RNA, ma in un recente articolo è stato dimostrato che questa regione di FMRP è in grado di legare specificamente omopolimeri di RNA in vitro (Adinolfi et al., 2003). Inoltre, utilizzando costrutti di delezione per BC1, abbiamo osservato che il riconoscimento di FMRP coinvolge l’estremità 5’ di questo RNA che si struttura come una lunga forcina. Un dato molto interessante è che questa regione di BC1 è la stessa regione che mostra complementarietà con gli mRNAs target di FMRP (Zalfa et al., 2003), suggerendo quindi che FMRP possa giocare un ruolo diretto nell’appaiamento BC1/mRNAs (Zalfa et al., submitted). In accordo con questi dati è stato recentemente dimostrato che FMRP ha molte caratteristiche proprie di uno chaperone degli acidi nucleici che è in grado di favorire e stabilizzare le interazioni RNA-RNA (Gabus et al., 2004). L’RNA BC1 è specifico dei roditori, ma nei primati e nell’uomo esiste un potenziale analogo di BC1, chiamato BC200. L’RNA BC200 è molto simile a BC1 per pattern di espressione, per distribuzione intra-neuronale e per putativa struttura secondaria, suggerendo un ruolo di questo piccolo RNA non-codificante nel trasporto e/o nella traduzione degli mRNAs dendritici. Noi abbiamo dimostrato che BC200, il quale presenta forti complementarità di sequenza con gli mRNA umani Arc, a-CaMKII e MAP1B (Zalfa et al., 2003), fa parte del complesso di FMRP in cellule neuronali umane ed è in grado di legarsi fortemente e direttamente al dominio N-terminale di FMRP umana (Kdapp ~ 360 nM). Questo suggerisce che questi due piccoli RNA non codificanti svolgano lo stesso ruolo funzionale nelle cellule neuronali murine e di mammifero rispettivamente, contribuendo ad un livello di regolazione di importanti processi biologici più alto, come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP alle sinapsi. In conclusione, quando FMRP non è presente, la mancanza di repressione traduzionale di importanti proteine sinaptiche mediata dal complesso FMRP/BC200 può portare al fenotipo neuronale osservato nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Inoltre, poiché le funzioni cerebrali come la capacità di apprendimento e la memoria dipendono dalla funzionalità sinaptica, i nostri dati suggeriscono fortemente che mutazioni nel dominio N-terminale di FMRP o nella forcina 5’ dell’RNA BC200 possano essere la causa di casi di Sindrome dell’X Fragile in cui la proteina FMRP è normalmente espressa (Clarke et al., 2004).