Maldi-tof mass spectrometry application to the study of virus-host interactions

Proteins are involved in almost all biological processes. Besides their key roles in intracellular metabolism, and intracellular and intercellular signalling, proteins functions play a significant role in the immune system response and interactions between pathogen and host. This work had the aim to investigate the mechanisms of HCV replication and the impact of infection into the host cell in such a way to get the most representative system of in vivo infection. We used the 'replicon system' and a proteomic approach looking for differences in the proteome expressed by Huh7 cells in the presence or absence of HCV replicon. Looking to virus-host interaction, namely the host immune reaction to the presence of a virus, we have also apply the proteomic analysis to investigate Mixed Crioglobulinemia, that is one of the most common extracellular manifestation of HCV infection. Moreover, to better test this kind of technical approach in the investigation of virus-host interaction, we applied the same analysis to SARS-CoV infected cells. The basic experimental strategy adopted was to compare the proteomes of normal (control) and treated cells (transfected with HCV replicon or infected with SARS-CoV). Qualitative and quantitative differences were scored and proteins of interest further processed for identification. In the case of cryoglobulins-analysis all spots were analysed. The application of the proteomic approach 2D-PAGE / MALDI-TOF to investigate host-virus interactions seems to be not always successful. HCV is a very low rate replicating virus which seems to be able to induce a persistent chronic infection without disturbing the normal function of the host cell. The application of the same approach on SARS-CoV seems to be very promising. Concerning the investigation on cryoglobulins, this approach has been appropriate for the identification of protein content of the cryoprecipitates.We have identified 20 proteins and confirmed the precense of monoclonal IgM-RF WA cross idiotype and the precense of the IgM-associated protein Spα. This work has provided interesting information useful for further analytical investigation towards the comprehension of mechanism involved in the immune system response and their failures as possible causes of malignancies.

Viene definito proteoma l’insieme di tutte le proteine espresse dal sistema in studio nelle determinate condizioni in cui viene osservato. Le proteine giocano un ruolo significativo nella risposta del sistema immunitario e nelle interazioni fra l'agente patogeno e l'ospite, oltre alle loro funzioni chiave nel metabolismo cellulare, nel signaling intra- e inter-cellulare. Il lavoro di questa tesi ha avuto come scopo quello di investigare, mediante analisi proteomica, i meccanismi di replicazione di HCV e l'effetto dell'infezione nella cellula ospite. Volendo osservare l'interazione virus-ospite, vale a dire la reazione immunitaria dell’ospite alla presenza di un virus, abbiamo applicato l'analisi proteomica allo studio della Crioglobulinemia Mista, una della manifestazioni extracellulari più comuni dell'infezione da HCV. Inoltre, per testare questo approccio nell'indagine su interazioni virus-ospite, è stato applicato lo stesso sistema di analisi a cellule infettate con SARS-CoV. La strategia sperimentale di base consisteva nel confrontare il proteoma delle cellule huh7 (controllo) e trattate (transfettate con il replicone di HCV o infettato con SARS-CoV). Le differenze qualitative e quantitative sono state annotate mediante analisi di immagine e le proteine di interesse tagliate e digerite per l’identificazione mediante spettrometria di massa. Nel caso dei crioprecipitati ottenuti da pazienti HCV, sono state analizzate tutte le proteine. L'applicazione della separazione elettroforetica bidimensionale 2D-PAGE in combinazione con l’analisi allo spettrometro di massa MALDI-TOF nello studio delle interazioni virus-ospite non sempre sembra dare i risultati sperati. HCV è un virus con una velocità di replicazione molto bassa, che sembra poter indurre un'infezione cronica persistente senza disturbare le normali funzioni delle cellule ospiti. L'applicazione dello stesso metodo nello studio dell’infezione con SARS-CoV sembra essere più promettente. Per quanto riguarda la caratterizzazione delle crioglobuline, questo metodo ha permesso l'identificazione del contenuto proteico dei crioprecipitati. Sono state identificate 20 proteine ed è stata conferamta la presenza di IgM-RF monoclonali, idiotipo WA e della proteina Spα associata alle IgM. Questo lavoro ha fornito informazioni interessanti e, speriamo, utili nella comprensione dei meccanismi di risposta del sistema immunitario ed i relativi malfunzionamenti come possibili cause di patogenesi.