Transdifferenziamento lentogeno e retinogeno in xenopus laevis

SUMMARY Lens transdifferentiation After lentectomy through the pupillary hole, the outer cornea of larval X. laevis can undergo transdifferentiation to regenerate a new lens. This process is elicited by inductive factor(s) produced by the neural retina. During embryogenesis, the outer cornea develops from the outer layer of the presumptive lens ectoderm (PLE) under the influence of the eye cup and the lens. In this part of my thesis, we investigated whether the capacity of the outer cornea to regenerate a lens is the result of early inductive signals causing lens-forming bias and lens specification of the PLE, or late inductive signals causing cornea formation or both signals. Fragments of larval epidermis or cornea developed from ectoderm that had undergone only one kind of inductive signals, or both kinds of signals, or none of them, were implanted into the vitreous chamber of host larvae. The regeneration potential and the lens-forming transformations of the implants were tested using an antisense probe for pax6 as an earlier marker of lens formation and a monoclonal antibody anti-lens as a definitive indicator of lens cell differentiation. Results demonstrated that the capacity of the larval outer cornea to regenerate a lens is the result of both early and late inductive signals and that either early inductive signals alone or late inductive signals alone can elicit this capacity. In larval X. laevis the capacity to regenerate a lens is restricted to the outer cornea and pericorneal epidermis (Lentogenic Area, LA). However, in early embryos, the whole ectoderm is capable of responding to inductive factors of the larval eye forming lens cells. In this part, we have analyzed 1) the decrease of the lens-forming capacity in ectodermal regions both near LA (head epidermis) and far from LA (flank epidermis) during development, 2) the capacity of the head epidermis and flank epidermis to respond to lens-competence promoting factors released by an eye transplanted below these epidermal regions, and 3) the eye components responsible for the promoting effect of the transplanted eye. Results were obtained by implanting fragments of ectoderm or epidermis into the vitreous chamber of host tadpoles and by evaluating the percentage of implants positive to a monoclonal antibody anti-lens. We demonstrated that in the flank region the lens-forming competence is lost at the embryonic stage 30/31 and it is weakly restored by eye transplantation; however, in the head region the lens-forming competence is lost at the larval stage 48 and it is strongly restored by eye transplantation. Results obtained after transplantation of eyes deprived of some components indicate that the lens and the retina are the main source of these promoting factors. The immunohistochemical detection of the FGFR-2 protein in the epidermis of stage 53 larvae submitted to eye transplantation at stage 46 showed that the eye transplantation increased the level of FGFR-2 protein in the head epidermis but not in the flank epidermis, indicating that the lens-forming competence in X. laevis epidermis could be related to the presence of an activated FGF receptor system in the responding tissue. Retina transdifferentiation This study examined the retina transdifferetiation (TD) of RPE fragments implanted into the vitreous chamber of not lentectomized host eyes. In these experimental conditions, most RPE implants transformed into polarized vesicles resembling “inverted eyes” in which the side adjacent to the lens maintained the RPE phenotype, while the side adjacent to the host retina transformed into a laminar retina.The phases of the TD process were followed using BrdU labeling as marker of the proliferation phase and a monoclonal antibody (mAbHp1) as a definitive indicator of retina formation. Pigmented RPE cells do not express pax6. In the early phase of RPE to retina TD all depigmented and proliferating precursor cells expressed pax6. Changes in the pax6 expression pattern became apparent in the early phase of the outer nuclear layer (ON) differentiation, when pax6 expression decreased in the presumptive ON of the new-forming retina. Finally, during the late differentiation phase, the (ON), which contains photoreceptors, no longer expressed pax6 and this expression was confined to the ganglion cell layer and the inner nuclear layer. Given the substantial identity of pax6 expression during retinal development and RPE to retina TD, these observations suggest that pax6 is necessary for correct retina formation, indicating that retina development and RPE-retina TD are highly related processes. Xdach expression during development Two Xenopus Dachshund genes, XdachA and XdachB, were isolated, whose cDNAs were 2273 and 2117 bp long, respectively. They contained full-length open reading frames of 610 and 558 amino acids and showed an amino acid sequence highly similar to murine Dach1 (70%) and chick Dach1 (60%). The two Xenopus proteins presented a marked similarity (about 95%) at the level of the Dachbox-N of other Dach proteins and a low level of similarity (about 30%) at that of the Dachbox-C. DachA and DachB expression was analyzed by “whole mount” in situ hybridization and RT-PCR on embryos, at stages between 12 and 34, larval brain, eye and limb buds. The two genes are expressed in overlapping patterns during eye, ear, brain and limb development and show a significant expression similarity to mouse and chick Dach1.

SOMMARIO Transdifferenziamento lentogeno Le larve di X. laevis possono rigenerare il cristallino per un processo di transdifferenziamento della cornea esterna in fibre della lente. Tale fenomeno è promosso da un induttore retinico. L’ectoderma corneale deriva dallo strato esterno dell’ectoderma presuntivo lentogeno (PLE) per cui, nelle fasi iniziali dello sviluppo dell’occhio, è interessato dalle azioni induttive che portano alla formazione della lente da parte dello strato profondo del PLE (induzioni precoci). L’induzione della cornea avviene nelle fasi finali dello sviluppo dell’occhio, grazie all’azione induttrice esercitata dalla coppa ottica e dalla lente sull’ectoderma antistante (induzioni tardive). Mi sono chiesto in primo luogo quali fossero i segnali responsabili del mantenimento della capacità lentogena nell’area lentogenica larvale. Per tale ragione, sono stati impiantati nella camera vitrea di larve ospiti frammenti di cornea o di epidermide larvale, sviluppati da un ectoderma che era stato raggiunto, durante lo sviluppo embrionale, da un solo tipo di segnale induttivo (precoce o tardivo) o da entrambi i segnali induttivi (precoci e tardivi); altri frammenti impiantati nella camera vitrea derivavano invece da un ectoderma che non aveva ricevuto nessuno di questi segnali. La capacità lentogena degli impianti è stata valutata utilizzando una sonda antisenso per pax6, mentre l’effettiva trasformazione lentogena degli impianti è stata analizzata utilizzando un anticorpo monoclonale anti-lente. Nel complesso, i risultati ottenuti hanno dimostrato che la capacità della cornea esterna e dell’epidermide pericorneale di rigenerare una lente è il risultato sia delle induzioni precoci, che causano lo sviluppo della lente dal PLE, sia delle induzioni tardive, coinvolte nel differenziamento della cornea. Inoltre, le sole induzioni precoci o le sole induzioni tardive sono sufficienti a mantenere la potenzialità lentogena nell’area lentogenica larvale. Nei primi stadi embrionali la capacità lentogena non è confinata unicamente all’area lentogenica (PLE e regioni immediatamente circostanti), ma è presente in tutto l’ectoderma (Henry and Mittleman, 1995). Perciò, successivamente ho analizzato: a) il decremento della capacità lentogena in una regione ectodermica vicina all’area lentogenica (ectoderma della testa) e in una lontana (ectoderma del fianco), b) la capacità dell’epidermide della testa e del fianco di rispondere ai segnali, rilasciati da un occhio trapiantato, promuoventi la competenza lentogena, c) le parti dell’occhio responsabili dell’effetto promuovente la competenza lentogena. I risultati sono stati ottenuti impiantando nella camera vitrea di larve ospiti frammenti di ectoderma o di epidermide e determinando, in seguito, la percentuale di impianti positivi all’anticorpo anti-lente. I risultati hanno dimostrato che, durante lo sviluppo embrionale e larvale, la competenza lentogena decresce molto più rapidamente nell’ectoderma del fianco che in quello della testa. I risultati ottenuti dopo il trapianto di occhi privati di alcune parti dimostrano che i fattori promuoventi la competenza lentogena sono rilasciati sia dalla lente che dalla retina. Infine, l’analisi della distribuzione del recettore FGFR-2, nella cornea, nell’epidermide e nell’epidermide sotto cui è stato trapiantato un occhio, indica che la competenza lentogena potrebbe essere correlata alla presenza di tale recettore nel tessuto rispondente. Transdifferenziamento retinogeno In questa parte della tesi, ho analizzato il transdifferenziamento in senso retinico di frammenti dell’epitelio pigmentato (RPE), impiantati nella camera vitrea. Le diverse fasi del processo di transdifferenziamento (depigmentazione, proliferazione e differenziamento) sono state seguite utilizzando la marcatura con BrdU come marker della fase proliferativa e l’anticorpo monoclonale mAbHp1 come indicatore del completamento della fase differenziativa. Inoltre, ho analizzato durante il processo di transdifferenziamento il pattern spazio-temporale di espressione di pax6. I risultati hanno dimostrato che nella maggior parte degli impianti, localizzati nella camera vitrea dell’occhio di una larva ospite, solo la parte della vescicola rivolta verso la retina ospite transdifferenziava in una retina laminare, mentre la parte rivolta verso la lente rimaneva densamente pigmentata. Il quadro di espressione di pax6 durante il processo di transdifferenziamento retinogeno ricalca quello osservabile durante il normale sviluppo della retina, ciò indica che sviluppo e rigenerazione della retina sono processi strettamente correlati. Espressione di Xdach durante lo sviluppo Lo sviluppo dell’occhio, dai Vertebrati agli Invertebrati, è regolato da uno stesso network di geni interagenti (pax6/eya1/six3/dach1) (Hanson, 2001). In Xenopus laevis, finora sono stati clonati i geni pax6, eya e six3 (Lupo et al., 2000). Nell’ultima parte di questa tesi ho clonato il gene Dachshund in Xenopus (Xdach) e ne ho delineato il quadro di espressione durante lo sviluppo embrionale e larvale. Mediante ibridazione in situ ho dimostrato che tale gene è espresso nel SNC, nella retina, nell’orecchio e nell’arto in sviluppo. In una successiva fase della ricerca, sarà interessante analizzare il ruolo di Xdach nel transdifferenziamento retinogeno.