Danno e riparazione del DNA in PBMC di soggetti giovani e anziani

The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) complex plays a crucial role in radiation induced DNA damage recognition and repair. The complex includes the ku heterodimer, which comprises ku 70 and ku 80 subunits, that binds DNA termini of double strand breaks (dsb) without sequence specificity, and the catalytic subunit DNA-PKcs. The kinetics of DNA repair was studied in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from subjects of different ages (7 young, ranging from 20 to 35 years, and 7 elderly, ranging from 80 to 95 years). Formation of phosphorilated H2AX (γ- H2AX) foci was determined to analyse DNA damage and repair. Moreover radiation induced changes in the DNA-binding activity of the ku heterodimer and in the concentrations of ku 70 and ku 80 were determined in nuclear and cytoplasmic extracts. γ-H2AX foci was visible rapidly after X-ray treatment both in young and elderly subjects, but they persist much longer in PBMC from elderly people. Also the kinetics of radiation induced changes in expression of ku 70 and ku 80 and in DNA binding activity of ku heterodimer were different between two groups of subjects analysed. These findings suggest major steps involved in DNA-PK activation and the intracellular and molecular changes that may account for the age-dependent impairment of DNA repair capacity in irradiated mammalian cells.

Il complesso DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) svolge un ruolo essenziale nel riconoscimento e nella riparazione dei Danni del DNA indotti dale radiazioni ionizzanti. Il complesso DNA-PK è formato dall’eterodimero ku, composto dalle subunità ku 70 e ku 80, in grado di legare senza specificità di sequenza le estremità libere delle rotture a doppio filamento (double strand breaks, dsb) del DNA, e dalla subunità catalitica DNA-PKcs. In questo lavoro è stata studiata la cinetica della riparazione del DNA in cellule mononucleate di sangue periferico (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) purificate da soggetti di diversa età (7 giovani di età compresa tra 20 e 35 anni, e 7 anziani di età compresa tra 80 e 95 anni). La formazione dei foci di riparazione evidenziati dalla forma fosforilata dell’istone H2AX (γ-H2AX) è stata analizzata per determinare i danni e la riparazione del DNA. Inoltre sono stati determinate, in estratti nucleari e citoplasmatici, le variazioni indotte dalle radiazioni nell’attività di legame al DNA dell’eterodimero ku e nelle concentrazioni delle proteine ku 70 e ku 80. I soci di γ-H2AX foci sono visibili rapidamente in seguito al trattamento con raggi X, sia in soggetti giovani che anziani, ma persistono più a lungo nei PBMC di soggetti anziani. Anche la cinetica di espressione di ku 70 e ku 80 e di attività di legame dell’eterodimero ku dopo irraggiamento sono differenti nei due gruppi di soggetti analizzati. Questi risultati suggeriscono la presenza di diversi stadi di attivazione del complesso DNA-PK in grado di spiegare i difetti età dipendenti nella capacità di riparazione del DNA in cellule di mammifero irradiate.