Il meccanismo di azione del peptide antibiotico Tricogina GA IV: studi chimico-fisici su analoghi fluorescenti

“Mechanism of membrane perturbation by the antibiotic peptide Trichogin GAIV: a physico-chemical study on fluorescent analogs” dr. Claudia Mazzuca Trichogin GA IV is the main component of the lipopeptaibol family, an important class of antibiotic linear peptides, which exert their action by perturbing the permeability of cell membranes, without interacting with any specific receptor. Trichogin sequence is characterized by an N-terminal fatty acyl group, a C-terminal 1,2-amino alcohol and a high proportion of Aib residues: Oct-Aib-Gly-Leu-Aib-Gly-Gly-Leu-Aib-Gly-Ile-Lol where Oct is n-octanoyl and Lol is leucinol. This peptide displays a remarkable antibacterial and hemolytic activity, but the details of its mode of action are still unsettled. In order to characterize the behavior of trichogin, we decided to take advantage of the high sensibility of fluorescence spectroscopy: therefore, two trichogin analogues marked with fluorescent probes (fluorene and azulene) were synthesized: Oct-Aib-Gly-Aal-Aib-Gly-Gly-Leu-Aib-Gly-Dab(Boc)-Leu-OMe (A3) Oct-Aib-Gly-Leu-Aib-Gly-Gly-Leu-Aib-Gly-Dab(Fmc)-Leu-OMe (F10) where Aal denotes b-(1-azulenyl)-L-alanine and Fmc the fluorenyl-9-methylcarbonyl group. These analogs display structural and functional properties comparable to those of the parent peptide. To clarify the mechanism of action (pore formation, ion carrier or detergent- like mechanisms), we compared the outcomes of several independent experiments. Release measurements of markers of different size from liposomes, and scattering measurements allowed us to rule out micellization as the trichogin mechanism of membrane perturbation. These results were confirmed by optical microscopy experiments performed on giant unilamellar vesicles. On the other hand, an ion-carrier mode of action was also excluded, based on peptide-induced leakage experiments using liposomes with membranes of different viscosities. Indeed, voltage-dependent measurements on BLMs confirm that trichogin acts by forming channels of well-defined size The molecular details about trichogin mode of action were first investigated performing time-resolved fluorescence experiments. These measurements demonstrate that in water trichogin analogs have a strong tendency to self-associate. A monomer-aggregate equilibrium is found also in the membrane phase. The relative population of the four species present in a water-membrane system, and the constants regulating the equilibria among them were determined. Interestingly, we found that while aggregates are present both in solution and in the lipid phase, membrane leakage is due to peptide oligomers only. Fluorescence quenching experiments were then performed with water-soluble quenchers (iodide and acrilamide) and with lipids labeled with the doxyl quencher at different positions along the chain. These data show that trichogin is inserted in the lipid phase: at peptide concentration values where no membrane leakage is observed, both the azulene of A3 and the fluorene of F10 are positioned at about 10 Å from the bilayer center. However, as peptide concentration reaches values able to induce liposome leakage, the quenching caused by doxyls located near the center of the bilayer increases markedly, indicating a change in peptide topology. A strict correlation between the fraction of peptide deeply inserted in the membrane and the fraction of trichogin aggregates was found. Therefore, we can conclude that the increase in peptide concentration brings about a two-state transition from a monomeric, surface-bound and inactive peptide to a buried, aggregated state, forming channels responsible for membrane leakage and bioactivity.

“Il meccanismo di azione del peptide antibiotico Tricogina GA IV: studi chimico-fisici su analoghi fluorescenti” dr. Claudia Mazzuca La Tricogina GA IV è il componente principale della famiglia dei lipopeptaibolici, un’importante classe di peptidi lineari, che agiscono perturbando il doppio strato lipidico. La sua sequenza è:: Oct-Aib-Gly-Leu-Aib-Gly-Gly-Leu-Aib-Gly-Ile-Lol dove Oct è il gruppo n-octanoile e Lol il leucinolo. Questo peptide risulta essere estremamente attivo nei confronti di batteri ed eritrociti; tuttavia, i dettagli del suo meccanismo d’azione non sono ancora stati chiariti. Al fine di studiare in dettaglio il comportamento della tricogina attraverso l’impiego della spettroscopia di fluorescenza (tecnica particolarmente sensibile), sono stati sintetizzati due analoghi – chiamati A3 ed F10 – contenenti le sonde fluorescenti azulene e fluorene rispettivamente in posizione 3 e 10 della catena. Per stabilire quale sia, tra i tre possibili (formazione di canali, trasportatore di ioni o micellizzazione), il meccanismo d’azione del peptide, sono stati confrontati i risultati di diversi esperimenti indipendenti. In particolare, misure di luce diffusa e di rilascio di sonde di differenti dimensioni dai liposomi hanno permesso di escludere la micellizzazione. Questo risultato è stato anche confermato da esperimenti di microscopia ottica su liposomi giganti. Inoltre, è stato possibile escludere anche che il peptide agisca da trasportatore di ioni, sulla base di misure di rilascio effettuate su membrane a differente viscosità. Scendendo più in dettaglio a livello molecolare, esperimenti di fluorescenza risolta in tempo hanno mostrano la presenza di un equilibrio monomero-aggregato non solo in acqua, ma anche in membrana: è stato quindi possibile determinare sia le popolazioni relative delle quattro specie che le costanti che regolano gli equilibri tra esse. È stato inoltre possibile dimostrare che solamente gli aggregati in fase lipidica sono responsabili della permeabilizzazione della membrana. Esperimenti di smorzamento di fluorescenza da parte di lipidi marcati con il gruppo dossile in differenti posizioni lungo la catena hanno mostrato che il peptide è inserito all’interno della membrana: per valori di concentrazione peptidica ai quali non si ha attività, sia l’azulene di A3 che il fluorene di F10 sono posizionati a circa 10 Å dal centro del doppio strato. Tuttavia, quando la concentrazione peptidica raggiunge valori sufficienti ad avere attività, lo smorzamento causato dai dossili posizionati vicino al centro del doppio strato aumenta significativamente, indicando un cambiamento nella topologia del peptide. Si è osservata una stretta correlazione tra la frazione di peptide profondamente inserito in membrana e la frazione di aggregati. Si può quindi concludere che l’aumento della concentrazione peptidica provoca una transizione a due stati da una forma monomerica inattiva, localizzata sulla superficie della membrana ad una forma aggregata, inserita all’interno del doppio strato, la quale, formando canali, è responsabile della permeabilizzazione e dell’attività biologica.