Investigation of human topoisomerase 1b activity through a domain substitution and interaction with a new synthetic inhibitor

Plasmodium falciparum infection is one of the most frequent acquired red blood cell disease worldwide. The spread of multi-drug-resistant strains has increased the need to identify new molecular targets for antimalarial therapy. DNA topoisomerases may be considered possible candidates, due to their important role in cellular activities, including DNA replication. DNA topoisomerase I (Top1) relaxes supercoiled DNA by a transient DNA strand breakage, rotation, and religation. The human Top1 (hTop1) comprises a conserved protein clamp, tightly wrapped about the DNA duplex, formed by three protein domains and an extended coiled-coil linker domain that appropriately positions the C-terminal active site tyrosine against the core to form the catalytic pocket. The linker has been shown to be important in controlling the enzyme catalytic mechanism. After removal of the linker domain, hTop1 loses inter-domain communication, thus highlighting the importance of linker in controlling the religation and modulating CPT sensitivity. The Plasmodium falciparum topoisomerase I (PfTop1) contains a longer linker, compared to the human homologue. This finding pushed us in exploiting its structural and functional properties in enzyme activity and drug sensitivity swapping the hTop1 linker domain with the corresponding one of PfTop1. Moreover, as the linker domain specifically affects the religation reaction, a pentaciclic-diquinoid synthetic compound, KuQ, has been designed and its effect has been analyzed through activity assays and molecular docking, identifying crucial elements for this step of the hTop1 activity.

Il Plasmodium falciparum è l’agente eziologico della malaria umana. La diffusione di ceppi multi- resistenti ai farmaci ha reso necessaria l’identificazione di nuovi bersagli molecolari per la terapia antimalarica. Le DNA topoisomerasi, responsabili della regolazione della topologia del DNA durante fondamentali processi biologici, possono essere considerate possibili candidati. La DNA topoisomerasi 1 (Top1) risolve i superavvolgimenti accumulati dalla doppia elica del DNA catalizzando il processamento di uno dei due filamenti, la rotazione e la risaldatura. La Top1 umana (hTop1) ha una struttura bilobata costituita da tre domini proteici e un dominio linker che si estende dal dominio C-terminale, contenente il sito attivo. Il dominio linker svolge un ruolo fondamentale nel meccanismo catalitico dell'enzima. E’ stato dimostrato che in seguito alla delezione del linker nella hTop1, si perdono interazioni inter-dominio, evidenziando così la sua importanza nel controllo della risaldatura del DNA e nella modulazione della sensibilità verso la camptotecina (CPT), noto inibitore della hTop1. La topoisomerasi 1 del Plasmodium falciparum (PfTop1) presenta un linker di lunghezza maggiore rispetto all’omologo enzima umano; il ruolo strutturale e funzionale del dominio linker della PfTop1 è stato analizzato mediante il clonaggio di una Top1 chimera umana/plasmodio, hTop1(Pf-linker), in cui il dominio linker della hTop1 è stato sostituito con il relativo dominio della PfTop1. Inoltre, è stato sintetizzato un composto penta ciclico-dichinoide, Et-Kuq , ed analizzato il suo effetto sulla hTop1 mediante saggi di attività e docking molecolare, per mezzo dei quali è stato possibile comprenderne il meccanismo d’inibizione ed evidenziare elementi fondamentali della reazione di risaldatura.