Cytoglobin, a direct ΔNp63 target gene, counteracts oxidative stress in keratinocytes

p63 is a transcription factor belonging to p53 family. The members of this family share a substantial degree of homology but they are not functionally redundant. The ΔNp63α isoform plays a critical role in the formation of the epidermis, its expression level varies in the different layers of the epidermis, it is abundant in the basal proliferating layer and decreases in the upper differentiated layers. The epidermis undergoes to oxidative stress by production of reactive oxygen species (ROS) in a physiological manner, during normal aerobic metabolism. ROS also derive from the environment, ie. UV irradiation. In order to maintain the balance of the oxidative status, cells have protective antioxidant systems. Preliminary studies suggest that p63 could be involved in the oxidative defense. To identify p63 targets, possibly involved in the anti-oxidant defence, we have used t RT2 Profiler PCR Array. After TP63 silencing, we found 16 genes modulated, and we focused our attention on one gene, CYGB. CYGB codes for cytoglobin, a member of the globin protein family that facilitates diffusion of oxygen through tissues and acts as a scavenger for nitric oxide or other reactive oxygen species. We performed promoter activity assay, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, real-time PCR and western blot analysis to confirm the direct regulation of CYGB by ΔNp63α. We also performed studies to evaluate the biological role of cytoglobin in keratinocytes. In particular, we detected an increase of cell death and ROS levels in keratinocytes depleted of CYGB, this increase was even more consistent upon hydrogen peroxide treatments. The results obtained indicate that p63, and its target gene CYGB, has an important role in protecting keratinocytes from oxidative stress.

p63 è un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia di p53 insieme a p53 e p73. Essi presentano un certo grado di omologia ma non sono funzionalmente ridondanti. P63, and in particolare l’isoforma ΔNp63α svolge un ruolo importante nello sviluppo epidermico (proliferazione e differenziazione). Il suo livello di espressione varia nei diversi strati dell'epidermide, è abbondante nello strato basale e diminuisce negli strati superiori differenziati. L’epidermide è un tessuto fisiologicamente soggetto a stress ossidativo. La produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) può originare da varie fonti, possono essere prodotti nel corso del normale metabolismo aerobico della cellula oppure derivare dall’ambiente circostante. Studi recenti hanno rivelato un coinvolgimento di p63 nella risposta allo stress ossidativo. Allo scopo di identificare nuovi target di p63 nella risposta antiossidante, dopo aver osservato un aumento dei ROS intracellulari a seguito dell' inibizione di p63, abbiamo utilizzato un PCR array per analizzare l'espressione di una serie di geni appartenenti al metabolismo dei ROS. Questo metodo ci ha consentito di analizzare contemporaneamente 84 geni riguardanti lo stress ossidativo e la difesa antiossidante. In particolare, dopo il silenziamento di TP63, 11 geni presentavano una espressione ridotta e 5 aumentata. Ci siamo focalizzati sul gene CYGB, che codifica per la citoglobina, un membro della famiglia delle globine che facilitano la diffusione di ossigeno attraverso i tessuti e agiscono come scavenger di ossido nitrico o altre specie reattive dell'ossigeno. Attraverso saggi di attività del promotore, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), real-time PCR e analisi western blot abbiamo confermato la regolazione diretta della CYGB da parte di ΔNp63α. Esperimenti di silenziamento della citoglobina hanno mostrato che i cheratinociti risultano più sensibili allo stress ossidativo e che se trattati con perossido di idrogeno mostrano un aumento dei livelli di ROS e di apoptosi rispetto al controllo. I dati quindi indicano che p63, attraverso il suo target trascrizionale CYGB, ha un ruolo importante nel proteggere i cheratinociti dallo stress ossidativo.