La sovraespressione di Timp3 nei macrofagi protegge da insulino‐resistenza e aterosclerosi

Obesity is associated with low‐grade inflammatory state which prompts to diabetes and atherosclerosis. We found that activity and expression of Tissue inhibitor of Metalloproteinase 3 (TIMP3) are decreased in humans and mice affected by obesity. Because obesity is associated with increased macrophage accumulation in different tissues, we used a transgenic approach under control of CD68 promoter to reconstitute TIMP3 levels and we analyzed its effects on metabolic homeostasis. Transgenic (MacT3) mice were identified by RT‐PCR and confirmed by Southern blot. In MacT3 mice, TIMP3 overexpression was confirmed by RT‐PCR, Western blot and Reverse Zymography in spleen, liver, peripheral blood monocytes and bone marrow derived macrophages, treated or not with LPS. After 20 weeks of High Fat Diet (HFD), we observed that MacT3 mice compared with WT littermates showed a significant improved glucose tolerance and insulin sensitivity, measured by IPGTT and IPITT. Insulin, leptin, AST and ALT were lower and adiponectin increased in MacT3 mice compared with WT littermates. Histology of white adipose tissue (WAT), liver and aorta showed accumulation of lipids, intense fibrosis and increased inflammatory markers in WT compared with MacT3 mice. Expression profiling for metabolic and inflammatory genes revealed that MacT3 compared with WT have significant lower levels for MCP1, IL6, SOCS3 and SCD1 in WAT, and for SCD1, FAS, Srebp and G6Pase in liver. MacT3 mice showed also lower levels of pJNK and pSTAT3 in liver and in WAT. Next we analyzed the effect of Timp3 overexpression in the MacT3/LDLR‐/‐ and LDLR knockout mice fed Western Diet for 16 or 24 weeks. Histology of aortic roots from MacT3/LDLR‐/‐ mice revealed 60% reduction in plaque surface, ‐ 6 ‐ reduced F4/80, CD3 and nitrotyrosine staining, increased collagen content and no necrotic cores, when compared to LDLR‐/‐ littermates. Gene expression profiles in liver, wat and aorta suggest reduced oxidative stress and less activation of inflammatory pathways in MacT3/LDLR‐/‐ compared to LDLR‐/‐ mice. Our data indicate that macrophage specific overexpression of TIMP3 protects from lipotoxicity induced inflammation and related metabolic disorders.

L’obesità, caratterizzata da una risposta infiammatoria cronica di basso grado, predispone a disturbi metabolici come dislipidemia, diabete di tipo 2 ed aterosclerosi. Lʹinibitore tissutale di metalloproteinasi 3 (TIMP3), peptide ad azione anti‐infiammatoria, risulta ridotto negli appena menzionati disturbi metabolici. Poiché obesità ed aterosclerosi si associano ad infiltrazione macrofagica in vari tessuti, è stato generato un modello di animale transgenico in cui l’espressione di TIMP3 è sotto il controllo specifico del promotore CD68, quest’ultimo è in grado di dirigere preferenzialmente l’espressione del transgene nei macrofagi. I topi transgenici (MacT3) sono stati identificati mediante RT‐PCR e Southern blot. Tramite analisi Western blot è stato valutato il corretto processo di traduzione dell’mRNA in proteina mentre l’attività metalloproteinasica di TIMP3 è stata verificata mediante la tecnica di zimografia inversa. A seguito di una caratterizzazione preliminare gli animali MacT3 e WT sono stati nutriti con una dieta obesogenica (HFD) per 20 settimane. Al termine del trattamento, gli animali MacT3 mostrano, rispetto ai WT, un significativo aumento di tolleranza al glucosio e insulino‐sensibilità, misurate mediante analisi IPGTT e IPITT. Analisi istologiche su tessuto adiposo bianco, fegato e aorta hanno evidenziato un minor accumulo di lipidi e una riduzione di fibrosi e di marcatori di infiammazione nei MacT3 rispetto ai WT. Il profilo di espressione genica nel tessuto adiposo mette in evidenza nei MacT3 una ridotta infiammazione (con riduzione di marcatori quali F4/80, MCP1, SOCS3), ridotto stress ossidativo (con modulazione di NADPHox e SOD1) e un miglior profilo adipogenico (aumento di CEBP, PPARγ, β‐Klotho, riduzione di PREF‐1). L’analisi proteica, effettuata mediante Western Blot, mostra una ridotta fosforilazione di proteine infiammatorie, come JNK e STAT3, e un aumento della fosforilazione di AKT negli animali MacT3. Anche nel fegato si riscontra un miglioramento in termini di infiammazione e stress ossidativo, che si riflette in una diminuita steatosi nel topo transgenico. I topi MacT3 sono stati quindi incrociati con un modello murino di aterosclerosi, gli animali LDLR‐/‐, e sono stati sottoposti ad un regime di dieta aterogenica per 16 o 24 settimane. Analisi istologiche delle aorte hanno evidenziato una riduzione nella formazione della placca, l’aumento nel contenuto di collagene e l’assenza di core necrotici nel gruppo dei MacT3/LDLR‐/‐ rispetto ai controlli LDLR‐/‐. I nostri dati suggeriscono che TIMP3 eserciti un’azione di controllo protettivo nei confronti di stati infiammatori indotti da lipotossicità e disordini metabolici e rappresenta un potenziale target terapeutico per la cura di diabete ed aterosclerosi.