Regolazione differenziale della stabilità proteica delle isoforme TAp73 e DNp73 tramite la proteina RING finger ubiquitina ligasi “PIR2”

p73 is a p53-related transcription factor with fundamental roles in development and tumor suppression. Transcription from two different promoters on the p73 gene results in generation of transcriptionally active TAp73 isoforms and dominant negative DNp73 isoforms with opposing pro- and anti-apoptotic functions. Therefore, the relative ratio of each isoform is an important determinant of the cell fate. Proteasomal degradation of p73 is mediated by polyubiquitination-dependent and -independent processes both of which appear, thus far, to lack selectivity for the TAp73 and DNp73 isoforms. Here, we describe the characterization of another transcriptional target of TAp73; a ring finger domain ubiquitin ligase p73 Induced RING protein 2 (PIR2). Although PIR2 was initially identified a p53-induced gene (p53RFP), low abundance of PIR2 transcript in mouse embryonic fibroblasts of TAp73 KO mice compared with WT mice and comparison of PIR2 mRNA and protein levels following TAp73 or p53 overexpression substantiate TAp73 isoforms as strong inducers of PIR2. However, coexpression of PIR2 with TAp73 or DNp73 resulted in an increase of the TA/DNp73 ratio, due to preferential degradation of DNp73. Finally, PIR2 was able to relieve the inhibitory effect of DNp73 on TAp73 induced apoptosis following DNA damage. Although PIR2 expression was induced by DNA damage, its expression did not alter apoptotic response or cell cycle profile per se. These results suggest that PIR2, by being induced by TAp73 and degrading DNp73, differentially regulates TAp73/DNp73 stability, and, hence, it may offer a therapeutic approach to enhance the chemosensitivity of tumor cells.

La proteina p73 è un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia di p53 ed ha un ruolo fondamentale nello sviluppo e soppressione tumorale. P73 viene trascritto a partire da due differenti promotori generando isoforme che possiedono il dominio di transattivazione (TAp73) ed isoforme troncate (DNp73) con rispettive funzioni pro ed antiapoptotiche. In particolare, il relativo livello di espressione di queste due diverse isoforme è in grado di determinare il destino cellulare. La stabilità proteica di p73 è regolata da diversi meccanismi cellulari che non mostrano alcuna selettività per le due isoforme. Nel presente lavoro andremo a descrivere la caratterizzazione di un nuovo target trascrizione di TAp73; una RING finger ubiquitina ligasi indotta da TAp73, da noi denominata PIR2, che a sua volta è in grado di degradare p73 in modo selettivo. Inizialmente questa E3 ligasi era stata identificata da altri gruppi come un gene indotto da p53 (p53RFP), ma la scarsa presenza del suo trascritto nei fibroblasti embrionali murini (MEF) di topi knock-out per TAp73 comparata con il topo wild-type (WT) ed il paragone dei livelli di mRNA e di proteina di PIR2, in seguito ad over-espressione di TAp73 o p53, ci hanno mostrato che l’isoforma TAp73 è un forte induttore di PIR2. In seguito, abbiamo over-espresso PIR2 assieme a TAp73α o DNp73α, che sono le isoforme predominanti, ed abbiamo constatato un incremento del rapporto TA/DNp73 che è dovuto ad una preferenziale degradazione di DNp73α. In conclusione, PIR2 è stato capace di inibire gli effetti anti-apoptotici esercitati dall’isoforma DNp73α durante il processo apoptotico indotto da TAp73α, in seguito a danno al DNA. Malgrado l’espressione di PIR2 è indotto dal danno al DNA, la sua sola espressione non altera il ciclo cellulare e la risposta all’apoptosi. Questi risultati suggeriscono che PIR2 viene indotto da TAp73 così da aumentare la degradazione DNp73 ed infine regolare il rapporto intracellulare tra TA e DNp73, che a sua volta determina il destino cellulare. La scoperta di questo nuovo meccanismo di regolazione potrebbe offrire un ottimo approccio terapeutico per il potenziamento ed il perfezionamento degli attuali trattamenti chemioterapici.