Characterization of influenza viruses for the development of a microarray based diagnostic system

Influenza is an acute respiratory illness, due to a viruses belonging to the Orthomyxoviridae family, which occurs all over the world, causing considerable morbidity and mortality every year. Vaccination is the main influenza prevention method. The influenza surveillance network consists more than 130 National Influenza Centres, collaborating with four WHO Reference Centres, located in Atlanta, London, Melbourne, and Tokyo. This network helps to monitor influenza activity all over the world, allows the timely identification of virus variants emerging in the interpandemic period, and provides an antigenic and molecular evaluation of the variability of the influenza viruses circulating world-wide. Early diagnosis is crucial for influenza treatment and control and is also a key component of surveillance activity, for seasonal vaccine update and containment of pandemic strains. Influenza diagnosis can be made only in laboratory. Neverless the devices, for rapid diagnosis, available on the market are not enough sensitive and specific. This underlines the need for specific and sensitive point-of-care testing capable of discriminating between influenza types and subtypes. None of the available influenza diagnostic assays combines a point-of-care format with the multiplex capability to identify a large repertoire of human and animal viruses. For this reason an European FP-7 project was approved with the aim to develop an easy to use, microarray kit, combining several laboratories with different know hows has been developed. The principle of the microarray kit is based on sandwich ELISA. The partners working at the project (Istituto Superiore di Sanità-ISS, University of Perugia, Radim/Seac of Pomezia, Università di Bologna, Imperial College and Health Protection Agency-HPA in London) perform complementary activities, under the coordination of the Imperial College. In particular ISS, through the network influenza surveillance, is responsible for the screening, production and purification of viral strains. Virus strains, are used either for production or the screening of antibodies and for their characterization. The University of Perugia is responsible for mouse antibody production, while Imperial College has the task of developing the kit. The Radim/Seac is responsible for industrial production of the kit. The scope of my work was contribute to the work done by ISS, in the frame of this FP-7 European Project. Up to now, four antibodies, two against H1N1 and two against H3N2 human subtypes respectively were selected. Antibody cross-reactivity was tested by using a panel of human viruses representative of H1N1 and H3N2 strain circulating during the last ten years. The final part of the project, consisting of the production of antibodies against animal influenza viruses belonging to different antigenic antibodies, is currently in progress.

L‟influenza è una affezione respiratoria acuta, provocata da virus appartenenti alla famiglia degli Orthomyxoviridae. E‟ altamente contagiosa, facilmente trasmissibile per via aerea e rappresenta, pertanto, una delle malattie infettive più diffuse su scala mondiale. L‟elevato grado di variabilità antigenica di questi virus costituisce un ulteriore importante problema. A tal fine, l‟Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha predisposto Centri di osservazione e di rilevamento per l‟influenza in tutto il mondo che, collaborando con i quattro Centri di Riferimento OMS (Atlanta, Londra, Melbourne, Tokyo), permettono di identificare tempestivamente le varianti virali emergenti e di valutare, dal punto di vista sia antigenico che molecolare, il grado di variazione acquisita dai virus nel corso della loro circolazione nella popolazione. La diagnosi precoce è di cruciale importanza, sia per la sorveglianza dell‟influenza stagionale e il conseguente aggiornamento annuale della composizione vaccinale, sia per il controllo e il contenimento di ceppi pandemici. A causa della scarsa specificità del suo quadro clinico, l‟influenza può essere diagnosticata con certezza solo in laboratorio, impiegando metodiche virologiche piuttosto complesse e che richiedono l‟impiego di strumentazione e personale qualificati. I dispositivi di diagnosi rapida al momento in commercio non sono sufficientemente sensibili e specifici. A tale scopo nasce un progetto Europeo che unisce le competenze di diversi gruppi di ricerca, con l‟obiettivo di sviluppare un kit di diagnosi rapida, basato sul principio del microarray, in grado di diagnosticare tutti i tipi e sottotipi di virus influenzali in un unico saggio, rapido, sensibile e di facile esecuzione. La tecnologia impiegata si basa sull‟uso di anticorpi murini specifici, posti sull‟array, in grado di legare antigeni virali, eventualmente presenti nel campione clinico. L‟utilizzo successivo di un anticorpo murino coniugato, che riconosce il complesso anticorpo-antigene, permette l‟identificazione dell‟antigene virale presente nel campione. Le Unità Operative partecipanti al progetto (Istituto Superiore di Sanità-ISS, Università di Perugia, Radim/Seac di Pomezia, Università di Bologna, Imperial College e Health Protection Agency-HPA di Londra) svolgono attività e ruoli complementari, sotto il coordinamento dell‟Imperial College. In particolare: il dipartimento di Malattie Infettive Parassitarie e Immunomediate (MIPI), dell‟ISS, grazie alla rete di Sorveglianza, ha il compito di selezionare, produrre e purificare ceppi virali di diversi tipi/sottotipi influenzali utilizzabili sia per la produzione di anticorpi che per la loro caratterizzazione. L‟Università di Perugia ha il ruolo di produrre anticorpi murini. All‟Imperial College è affidata la messa a punto del saggio ELISA impiegato nel kit. La Radim/Seac è responsabile della produzione industriale del dispositivo. Scopo di questa tesi è stato descrivere lo svolgimento delle attività affidate all‟ISS. Allo stato attuale dell‟arte del Progetto, tra i numerosi anticorpi caratterizzati, sono stati selezionati quattro anticorpi, due dei quali specifici per il sottotipo H1N1 umano e due specifici per il sottotipo H3N2 umano. E‟ stata, inoltre, valutata la loro cross-reattività, utilizzando un pannello di ceppi, rappresentativi dei virus appartenenti agli stessi due sottotipi, circolanti negli ultimi dieci anni. Attualmente, nella fase finale, è in corso la produzione di anticorpi, prodotti contro virus influenzali animali, al fine di rendere le potenzialità diagnostiche del kit, più complete possibili.