Ruolo della sfingosina 1-fosfato nella risposta immunitaria all’ infezione da mycobacterium tuberculosis

In questa tesi è stato studiato il ruolo della sfingosina 1-fosfato (S1P) nella risposta immunitaria durante l’infezione da M. tuberculosis. La S1P è un lipide bioattivo che regola diverse funzioni biologiche cellulari. In questo contesto, è stata analizzata l’attività anti-micobatterica in cellule della linea monocito/macrofagica, THP-1 ed in una linea tumorale di cellule dell’epitelio alveolare, A549 infettate con il ceppo patogeno di M. tuberculosis H37Rv e stimolate con S1P. La crescita di M. tuberculosis è stata valutata tramite il saggio delle unità formanti colonia ed i risultati di questa analisi mostrano che la stimolazione con S1P determina un incremento dell’attività micobattericida di queste cellule. La S1P potrebbe rappresentare un componente della mucosa polmonare importante nel mantenere la sterilità al livello degli alveoli e nel regolare la risposta infiammatoria locale. In questo ambito, il passo successivo è stato quello di quantificare la S1P al livello del lavaggio broncoalveolare tramite saggio di competizione con 3HS1P. Questa analisi ha evidenziato che il contenuto di S1P al livello della mucosa polmonare di pazienti con tubercolosi polmonare attiva è più basso di quello osservato nei soggetti sani; inoltre il trattamento con S1P di cellule di lavaggio broncoalveolare (BAL) provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare attiva, ha messo in evidenza una riduzione della crescita intracellulare dei micobatteri endogeni. Questo risultato dimostra l’efficacia dell’azione svolta dalla S1P in un sistema cellulare che riflette quello presente nel polmone profondo in corso di malattia. Al fine di analizzare se la mucosa polmonare rappresentasse un sito di accumulo dei linfociti T CD4+CCR5+ e dei linfociti TCD4+CCR3+, entrambe queste sottopopolazioni cellulari sono state studiate nel BAL e nel sangue periferico di pazienti con tubercolosi, di soggetti con malattie polmonari non correlate alla tubercolosi e di soggetti sani. Questo studio ha messo in evidenza che i linfociti T CD4+ che esprimono il recettore CCR5 o CCR3 si raccolgono 4 maggiormente nel basso tratto respiratorio rispetto al sangue periferico e che, in accordo con l’osservazione che i linfociti T CD4 del polmone di pazienti con tubercolosi polmonare sono principalmente di tipo Th1, i linfociti T CD4+CCR5+ si accumulano in maggior misura nel polmone di pazienti con tubercolosi polmonare attiva. L’obiettivo successivo di questo lavoro è stato quello di determinare se una migliore uccisione intracellulare di M. tuberculosis, dopo la stimolazione con S1P, fosse associata ad una più efficiente risposta immunitaria, vista in termini di incremento della frequenza dei linfociti T CD4+CCR5+, specifici per M. tuberculosis. A questo scopo i PBMC provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare attiva, da soggetti con tubercolosi latente (PPD+) e da donatori sani (PPD-), sono stati infettati con M. tuberculosis e trattati con S1P. La risposta immunitaria specifica verso M. tuberculosis è stata valutata determinando la frequenza dell’espressione del CD69 su linfociti T CD4+CCR5+ del sangue periferico, dopo infezione con M. tuberculosis. I risultati di questa tesi mostrano che dopo la stimolazione con S1P dei PBMC provenienti da pazienti con tubercolosi polmonare, si assiste ad un aumento della percentuale di linfociti T specifici per M. tuberculosis senza un concomitante aumento della produzione di IFN-γ da parte delle stesse cellule. Questo risultato potrebbe essere spiegato con il fatto che nei pazienti con tubercolosi polmonare, la presenza delle cellule T regolatorie inibirebbe l’attivazione dei linfociti T specifici per M. tuberculosis, indotti dalla stimolazione con S1P, e quindi anche la produzione di IFN-γ. La mancata attivazione dei linfociti T specifici per M. tuberculosis si riflette anche in una mancata capacità di controllo della crescita intracellulare di M. tuberculosis nei PBMC di pazienti con tubercolosi polmonare dopo stimolazione con S1P; al contrario, in tre soggetti con tubercolosi latente, la stimolazione dei PBMC con S1P determina una diminuzione della crescita intracellulare di M. tuberculosis.