The e3 ubiquitin ligase wwp1 sustains growth of acute myeloid leukemia

Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a genetically heterogeneous aggressive disorder resulting from accumulation of multiple karyotipic, genetic or epigenetic changes that lead to impaired differentiation (class II mutations, targeting transcriptional factors such as PML-RARα) and increase self-renewal ability (class I mutations, usually targeting tyrosine kinases like FLT3-ITD, tumour suppressors like p53, and oncogenes like N-Ras) of hematopoietic progenitors. The whole spectrum of abnormalities underlying AML pathogenesis has not been fully elucidated. Further characterization of potentially druggable and prognostic relevant molecules might improve riskassessment and therapeutic strategies for AML patients. The E3 ubiquitin ligase WWP1 is a potential oncogene found deregulated in solid human cancers and its overexpression has been associated with increased solid cancer cell proliferation and survival. The oncogenic activity of WWP1 is empathized by the observation that a number of its protein targets are molecules relevant for the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Hence it is likely that pro-survival and growth promoting actions exerted by WWP1 in solid epithelial tumours arise from the regulation of relevant signalling pathways, and these mechanisms could be shared also in leukaemias. With the aim to investigate the role of WWP1 in the pathogenesis of myeloid leukaemogenesis, we have evaluated the expression profile of WWP1 in a cohort of patients with de novo AML, and found increased levels of WWP1 mRNA in the leukemic samples as compared to healthy donor controls. Noteworthy, inactivation of WWP1 in AML cell lines led to cell cycle arrest, decreased cell viability, and promoted differentiation of leukaemia cells, indicating WWP1 to be functionally relevant in AMLs. The use of the NB4 cell lines as an AML model-system, brought the attention on PML-RARα fusion protein regulation upon WWP1 knockdown. We found oncogene down-regulation at protein levels, with subsequent reactivation of the RARα target genes involved in granulocytic differentiation (e.g. C/EBPε). As a result, we observed induction of morphological and functional differentiating features upon WWP1-silencing in the NB4 cells as compared to the control group. The induction of autophagy as therapeutic mechanism of PML-RARα clearance in clinic brought us to investigate the possible involvement of the ligase in autophagy. We indeed found that depletion of WWP1 increased the autophagic flux of AML cells, thus contributing to the differentiation phenotype. Moreover, the non-apoptotic cell death observed in our system, highlighted a role for autophagy for the clearance of AML blasts. The cyclindependent kinase inhibitor p27 resulted our candidate as downstream target of WWP1: it is overexpressed at protein level when WWP1 is silenced in all the AML cell lines tested, and its is involved in G0/G1 cell cycle arrest, contributing to the growth arrest induction observed in NB4 cell line. Moreover, in vivo experiments showed that the survival of the mice transplanted with sh-WWP1 transduced NB4 cells was higher as compared to mice which received sh-Scr transduced NB4 cells, thus recapitulating the growth inhibition phenotype of AML cells seen in vitro. Together, these mechanisms point to unveil WWP1 biological effect in leukaemia sustainment, thus pointing at possible molecular targets for new therapeutic molecules.

La Leucemia Mieloide Acuta (AML) è una malattia aggressiva, geneticamente eterogenea, derivante da un accumulo di mutazioni cariotipiche, genetiche o epigenetiche, che portano ad un ridotto differenziamento (classe di mutazioni II, i cui target sono fattori di trascrizione, come PML-RARα) e aumentata capacità di auto-rinnovamento dei progenitori emopoietici (classe di mutazioni I, di solito coinvolgono tirosin chinasi come FLT3-ITD, soppressori tumorali come p53, ed oncogeni come N-Ras). L'intero spettro di anomalie sottostanti la patogenesi di AML non è stato completamente chiarito. Un’ulteriore caratterizzazione di molecole potenzialmente rilevanti e di marcatori prognostici potrebbe migliorare la valutazione dei rischi e le strategie terapeutiche per i pazienti con AML. L'E3 ubiquitina ligasi WWP1 è un potenziale oncogene trovato deregolato in tumori umani solidi e la sua sovra-espressione è stata associata ad un aumento della proliferazione e della sopravvivenza delle cellule tumorali. L'attività oncogenica di WWP1 è data dall'osservazione che un certo numero di suoi bersagli proteici sono molecole importanti per la regolazione della proliferazione cellulare, del differenziamento e dell’apoptosi. E’ quindi probabile che le azioni a favore di sopravvivenza e crescita esercitate da WWP1 in tumori epiteliali solidi derivino dalla regolazione di rilevanti vie di segnalazione, e questi meccanismi potrebbero essere condivisi anche dalle leucemie. Con l'obiettivo di indagare il ruolo di WWP1 nella patogenesi delle leucemie mieloidi, abbiamo valutato il profilo di espressione di WWP1 in una coorte di pazienti con de novo AML, e abbiamo trovato un aumento dei livelli del mRNA di WWP1 nei campioni ottenuti da pazienti affetti da leucemia, rispetto a quelli ottenuti da donatori sani, usati come controllo. È degno di nota il fatto che l'inattivazione di WWP1 in linee cellulari di AML portata ad arresto del ciclo cellulare, diminuzione della vitalità cellulare, e promuove il differenziamento delle cellule leucemiche, indicando che la funzione di WWP1 è rilevante nelle AML. L'utilizzo della linea cellulare NB4 come modello di sistema AML, ha posto particolare attenzione sulla regolazione della proteina di fusione PML-RARa. Sono stati così trovati down-regolati i livelli proteici dell’oncogene a seguito del silenziamento dell’E3 ubiquitina ligasi, con conseguente riattivazione dei geni bersaglio di RARα coinvolti nel differenziamento granulocitico (ad esempio, C/EBPε). Abbiamo così osservato l’induzione di caratteristiche morfologiche e funzionali di differenziamento nelle cellule NB4 silenziate per WWP1, rispetto al gruppo di controllo. In clinica, l'induzione di autofagia come meccanismo terapeutico della clearance di PML-RARα ci ha portato a indagare il possibile coinvolgimento della ligasi nel processo autofagico. Abbiamo così scoperto che la deplezione di WWP1 porta ad aumentato flusso autofagico nelle cellule AML, contribuendo al loro fenotipo di differenziamento. Inoltre, la morte cellulare non-apoptotica osservata nel nostro sistema, ha evidenziato un ruolo importante per l'autofagia nell’eliminazione dei blasti leucemici. p27, inibitore delle chinasi ciclina-dipendente, si è mostrato essere il bersaglio a valle del meccanismo di azione di WWP1: i suoi livelli proteici sono sovraespressi quando WWP1 viene silenziato in tutte le linee cellulari testate, ed essendo coinvolto nella fase G0/G1 del ciclo cellulare, contribuisce all’induzione dell’arresto della crescita osservata nella linea cellulare NB4. Inoltre, esperimenti in vivo hanno mostrato che la sopravvivenza dei topi trapiantati con cellule NB4 trasdotte con sh-WWP1 è stata maggiore rispetto ai topi che hanno ricevuto NB4 trasdotte con sh-Scr, ricapitolando così il fenotipo d’inibizione della crescita delle cellule AML osservato in vitro. Insieme, questi meccanismi puntano ad un effetto biologico di WWP1 nel sostentamento della leucemia, indicando in tal modo possibili bersagli cellulari per nuove molecole terapeutiche.