Functional role of the zinc finger factor ZNF281 in DNA damage response

The survival of organisms depends on the accurate transmission of genetic information from one cell to its daughters. Such faithful transmission requires not only extreme accuracy in replication of DNA and precision in chromosome distribution, but also the ability to survive spontaneous and induced DNA damage while minimizing the number of heritable mutations. Therefore, cells are constantly under threat from the cytotoxic and mutagenic effects of DNA damaging agents. To respond to these threats, eukaryotes have evolved the DNA damage response (DDR). The DDR is a complex array of different mechanisms that have the ability to sense DNA damage and transduce this information to the cell in order to modulate cellular responses to DNA damage. Cells possess several enzymatic tools capable of remodeling and repairing DNA; however, their activities must be tightly regulated in a temporal, spatial, and DNA lesion-appropriate fashion to optimize repair and prevent unnecessary and potentially deleterious alterations in the structure of DNA during normal cellular processes. During the past several years, considerable progress has been made in elucidating the components and the processes of the eukaryotic DDR. A central issue in this field, which remains to be understood in greater detail, is the identification of the controllers of the expression of DDR proteins. Interestingly, in recent years an increasing number of studies have revealed that several TFs regulate DNA repair directly and can function as integral components of the repair machinery itself in a transcription independent fashion. In fact, DNA damage-inducing insults (irradiation, chemotherapy drugs) promote translocation of some TFs directly to DNA lesions, where they actively facilitate DNA repair. ZNF281 is a zinc finger transcription factor involved in the control of cellular stemness and Epithelial Mesenchymal Transition (EMT). In this study we analyze the roles of ZNF281 during DDR. We report that ZNF281 expression increased after genotoxic stress caused by DNA damaging drugs (Etoposide, Doxorubicin, Camptothecin) in cancer cell lines, normal keratinocytes and in mouse skin in vivo. Comet assays demonstrated that DNA repair was delayed in cells silenced for the expression of ZNF281 and treated with Etoposide. Furthermore, RT profiler array analysis demonstrated that the expression of ten DDR genes was down-regulated in cells treated with Etoposide and silenced for ZNF281. In line with these findings, XRCC2 and XRCC4, two genes that take part in Homologous Recombination (HR) and Non Homologous End Joining (NHEJ) respectively, were transcriptionally activated by ZNF281 through a DNA binding-dependent mechanism as demonstrated by luciferase assays and Chromatin crosslinking ImmunoPrecipitation (ChIP) experiments. In addition, ZNF281 works as a c-Myc co-factor to stimulate the expression of nucleolin and cyclin B1; instead c-Myc, which also binds to the promoters of XRCC2 and XRCC4, was unable to promote their transcription or to modify ZNF281 activity. Bioinformatic analysis of 1971 breast cancer patients disclosed a significant correlation between the expression of ZNF281 and XRCC2. Moreover proteomic analysis and Proximity Ligation Assay (PLA) demonstrated that ZNF281 interacts with DNA-PK, an important protein of DDR, suggesting a transcription-independent role of ZNF281 in DDR. Our data highlight, for the first time, the involvement of ZNF281 in the cellular response to genotoxic stress through the control exercised on the expression of genes that act in different repair mechanisms and through interaction with with corecomponents of DNA repair pathways.

La sopravvivenza degli organismi dipende dall'accurata trasmissione dell'informazione genetica durante i processi che portano alla divisione cellulare. Questa fedele trasmissione richiede non soloun'elevata precisione nella replicazione del DNA e nella perfetta segregazione cromosomica, ma anche la capacità di sopravvivere ai danni al DNA spontanei o indotti minimizzando il numero di mutazioni ereditabili dalle cellule figlie. Le cellule sono constantemente soggette agli effetti citotossici e mutageni degli agenti in grado di causare danno al DNA. Per rispondere e difendersi da questa minaccia, le cellule eucariotiche hanno evoluto dei processi che sono collettivamente catalogati come risposta al danno al DNA (DDR). La DDR è una complessa via di trasduzione del segnale che ha la capacità di riconoscere la presenza di danni al DNA e trasdurre questa informazione nella cellula al fine di attivare i processi di riparo. Infatti, le cellule possiedono diversi enzimi capaci di rimodellare e riparare il DNA, comunque la loro attività deve essere spazialmente e temporalmente regolata per ottimizzare il riparo del DNA e prevenire potenziali e deleterie alterazioni nella struttura del DNA. In questi ultimi anni considerevoli progressi sono stati fatti per delucidare le componenti e i processi che caratterizzano la DDR eucariotica. Nonostante questo, un punto centrale in questo campo di studio rimane l'identificazione dei geni e delle proteine che controllano l'espressione delle proteine coinvolte nella DDR. Di interesse è la recente scoperta di un numero crescente di fattori di trascrizione che in grado di regolare direttamente la riparazione del DNA e che fanno parte come componenti integrali del macchinario di riparo stesso con meccanismi indipendenti dalla loro abilità di promuovere e/o reprimere la trascrizione. Infatti, gli agenti di danno al DNA (radiazioni, chemioterapia, agenti genotossici) sono in grado di promuovere la traslocazione di alcuni fattori di trascrizione direttamente sulle lesioni al DNA, dove partecipano all'attivazione del riparo al DNA. ZNF281 è un fattore di trascrizione appartenente alla tipologia degli "zinc finger" coinvolto nel mantenimento della staminalità cellulare e nei processi di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT). In questo studio vengono analizzati i ruoli di ZNF281 durante la DDR. Infatti, riportiamo che l'espressione di ZNF281 aumenta sia a livello di mRNA, che di proteina dopo stress genotossico indotto da agenti chimici che causano danno al DNA (etoposide, doxorubicina, camptotecina) in diversi sistemi quali le cellule tumorali, cellule di cheratinociti primari e nell’epidermide del Mus musculus. Il comet assay dimostra che il riparo al DNA è ritardato nelle cellule silenziate per l'espressione di ZNF281 e trattate con etoposide. Inoltre, l'analisi con RT profiler array ha dimostrato che l'espressione di dieci geni coinvolti nella risposta al danno al DNA è diminuita nelle cellule trattate con etoposide e silenziate per l'espressione di ZNF281. In linea con questa scoperta, XRCC2 e XRCC2, due geni che prendono parte rispettivamente ai processi di ricombinazione omologa (HR) e Non Homologous End Joining (NHEJ), sono trascrizionalmente attivati da ZNF281 attraverso un meccanismo dipendente dal legame al DNA come dimostrato da esperimenti di saggio della luciferasi e di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Inoltre, ZNF281 è un co-fattore della proteina c-Myc per l'attivazione dell'espressione della nucleolina e della ciclina B1; mentre c-Myc, anche se in grado di legare promotori di XRCC2 e XRCC4, non è capace di promuovere la trascrizione o di modificare l'attività di ZNF281 sui promotori di questi due geni. L'analisi bioinformatica di una coorte di 1971 pazienti affetti da cancro alla mammella rivela una correlazione statisticamente significativa tra l'espressione di ZNF281 e di XRCC2. Inoltre l'analisi proteomica e il proximity ligation assay (PLA) dimostrano che ZNF281 interagisce con DNA-PK, un'importante proteina del processo di DDR, suggerendo per ZNF281, un ruolo indipendente dalla trascrizione. In sintesi, i risultati discussi in questo lavoro, evidenziano per la prima volta il coinvolgimento di ZNF281 nella risposta cellulare a stress genotossici attraverso un controllo esercitato sull'espressione di geni che agiscono in differenti meccanismi di riparo al danno e attraverso la sua interazione con DNA-PK.