Molecular nexus between fak and ezh2 from fatty liver to hepatocellular carcinoma

NAFLD is one of the most common liver disease worldwide and it encompasses a wide range of liver injuries, ranging from simple steatosis (non-alcoholic fatty liver “NAFL”) to non-alcoholic steatohepatitis (“NASH”). NASH can be sometimes associated with hepatic fibrosis and may potentially progress to irreversible cirrhosis and in some cases to hepatocellular carcinoma (HCC). The number of HCC new cases with a NAFD-dependent aetiology has strongly increased during the last decade but the molecular mechanisms regulating NAFLD-related hepatocarcinogenesis remain to be explored yet. Among all the factors involved in HCC onset and progression different epigenetic mechanisms and signalling pathways, affecting cell homeostasis (e.g. cell proliferation, apoptosis, migration and invasion) may play a major role, but their action in NAFLD is still obscure and their connection with hepatocarcinogenesis is unknown. Interestingly, the focal adhesion tyrosine kinase (FAK) is often found overexpressed or hyper-phosphorylated in HCC patients suggesting a key role of this protein in the control of cancer cells behaviour. Similarly, the methyltransferase EZH2 has been recently associated with the process of hepato-carcinogenesis. Further, a recent study reported a positive correlation between FAK and EZH2 expression and their association with tumour aggressiveness in endometrial cancer. Therefore, a potential direct/indirect interplay between these proteins might affect the development of different tumours, including HCC. In this study, we point to investigate the role of FAK and EZH2 in in vitro and in vivo models of diet-induced NAFLD and of HCC. Our results demonstrated an increased expression of Tyr-397 phosphorylated FAK and of its target paxillin in vivo and in vitro NAFLD. Moreover, the silencing of FAK also promoted increased lipid accumulation via the activation of the de novo lipogenesis pathway in HepG2 cells. Interestingly, in a model of NAFLD-induced HCC, both total and pTyr397 FAK correlated with disease severity. We reported the first evidence of EZH2 connection to NAFLD observing a down-regulation of EZH2 in our in vitro and in vivo models. Furthermore, the pharmacological inhibition of EZH2 worsened liver steatosis and inflammation. Results obtained from human HCC xenografts on NOD/SCID micrevealed a crucial role of FAK in HCC development and progression. Accordingly, we found that silencing of FAK reduced cell proliferation and invasion, and induced apoptosis in HCC cells. Additionally, we demonstrated that the silencing of FAK critically affected EZH2 transcription, nuclear localization and H3K27 tri-methylation activity. Importantly, we found that p53 and E2F2/3 are key mediators of FAK-dependent effects on EZH2 expression/activity. In conclusion, we demonstrated a master role of FAK in NAFLD and HCC and provided strong evidence of its connection with EZH2, introducing a new protein network active in the control of cancer cells’ proliferation, in which p53 and E2F may act as mediators.

L’acronimo NAFLD (“non-alcoholic fatty liver disease”) comprende sia la condizione di steatosi epatica semplice sia la steatoepatite non-alcoolica (NASH: “non-alcoholic steatohepatitis”) caratterizzata da necroinfiammazione e dalla possibile presenza di fibrosi epatica. È stato dimostrato che la NASH può talvolta progredire fino a determinare l’insorgenza di cirrosi e/o di epatocarcinoma cellulare (HCC). Negli ultimi anni, numerosi studi hanno evidenziato un sostanziale aumento nel numero di casi con HCC correlato alla NAFLD, sia in presenza che in assenza di cirrosi epatica. Indipendentemente dall’eziologia, durante il processo di epatocarcinogenesi, numerose vie di trasduzione del segnale e di controllo di espressione genica risultano essere alterate. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della progressione della NAFLD verso un suo fenotipo pro-carcinogenico non risultano ancora del tutto chiariti. Tra le numerose proteine coinvolte nell’insorgenza e nella progressione dell’HCC, la proteina FAK (Focal Adhesion Kinase) è spesso trovata overespressa o iper-fosforilata in pazienti affetti da tumore, suggerendo un ruolo chiave per questa proteina nell’induzione del fenotipo neoplastico. Recentemente, anche la metil-transferasi EZH2 è stata associata al processo di epatocarcinogenesi e, in particolare, un recente studio ha evidenziato una correlazione positiva tra l’over-espressione di FAK ed EZH2 e l’aggressività del tumore in pazienti affetti da neoplasia endometriale, suggerendo un potenziale collegamento tra le due proteine. In questo studio, pertanto, abbiamo volto l’attenzione al ruolo di FAK ed EZH2 in modelli in vitro ed in vivo di NAFLD o di HCC. Gli esperimenti condotti sia sul modello in vitro che sul modello in vivo di NAFLD, hanno mostrato un aumento significativo della proteina FAK, della sua fosforilazione in tirosina 397 e della sua proteina target Paxillina. Tuttavia, il silenziamento di FAK in una linea cellulare di epatoblastoma umano è risultato essere associato con l’attivazione del processo di de novo lipogenesis e con un conseguente aumento dell’accumulo lipidico intra-cellulare. D’altro canto, gli esperimenti condotti su un modello murino di progressione della NAFLD verso l’HCC hanno evidenziato che livelli di FAK e della sua fosforilazione in tirosina 397 aumentavano parallelamente alla progressione del danno epatico fino all’insorgenza dei noduli tumorali. Abbiamo inoltre dimostrato, per la prima volta, il coinvolgimento di EZH2 nella NAFLD, riportando una correlazione inversa tra l’espressione di EZH2 e il grado di severità della malattia. Infine, un modello murino di epatocarcinoma è stato utilizzato per caratterizzare il ruolo di FAK nell’epatocarcinogenesi. In particolare, i nostri dati dimostrano che il silenziamento di FAK riduce drasticamente la crescita del tumore che esprime anche livelli più bassi di EZH2. Allo stesso modo, studi in vitro hanno evidenziato l’azione anti-proliferativa/pro-apoptotica del silenziamento di FAK in cellule di HCC. Entrando nel merito del potenziale meccanismo molecolare che potrebbe connetter le due proteine di nostro interesse, nelle cellule silenziate per FAK abbiamo riscontrato una riduzione del trascritto, della localizzazione nucleare e dell’attività di trimetilazione di EZH2. Sulla base di ulteriori risultati abbiamo dimostrato che p53 e E2F2/3 sono coinvolti nella regolazione della trascrizione di EZH2 mediata da FAK. Pertanto, in conclusione, in questo studio abbiamo dimostrato il ruolo chiave di FAK nella NAFLD e nell’epatocarcinoma, e abbiamo fornito evidenze dell’esistenza di una inter-connessione tra le proteine FAK ed EZH2, suggerendo p53 e E2F2/3 come possibili mediatori.