Characterization of TRAF2 aggregation state and its interaction with model membranes

The TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) is a member of the Tumor Necrosis Factor (TNF) receptor associated factor (TRAF) protein family which associate with, and mediate the signal transduction from members of the TNF receptor superfamily. Upon TNF receptor activation, TRAF2 is recruited at the receptor site resulting in the activation of downstream signaling cascades that, depending on the kind of stimulus, can lead to apoptosis or to cell survival. We have characterized both the protein secondary and tertiary structure as a function of temperature using conventional UV spectroscopy in cuvette (namely Circular Dicroism, steady-state and dynamic fluorescence) while the quaternary structure and aggregation state have been investigated by light scattering experiments. The stability and the protein unfolding/refolding transition have been also studied in detail using high hydrostatic pressure, chemical denaturing agents (guanidine) and temperature. We found that in solution, at room temperature, the protein exhibits an oligomeric structure compatible with that found in the crystal, which has been demonstrated to be a trimer of identical subunits. We also demonstrated that the TRAF2 quaternary structure stability is strongly dependent on the presence of 3 α-helices segments that are stuck together in the native, folded protein molecule. We also carried on a study to monitor the interaction of TRAF2 with model membranes (GUV) since it has been suggested that lipid rafts play a crucial role in the TRAF2 function. We were able to evaluate the diffusion rate of the protein within different kind of membranes, both synthetic and extracted from real tissues, using Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) techniques. We also used Laurdan Generalized Polarization and Spectral Phasor Analysis to study how TRAF2 affects the membrane fluidity. Our results demonstrated that TRAF2 exert a mechanical effect on the lipid bilayer since its addition to GUVs induces the formation of intraluminar vesicles.

Il TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) è un membro della famiglia di proteine Tumor Necrosis Factor (TNF) receptor associated factor (TRAF) che si associano e mediano la trasduzione del segnale tra i membri della superfamiglia dei recettori TNF. In seguito all’attivazione del recettore TNF, TRAF2 è reclutata al sito del recettore determinando l’attivazione di cascate di segnale a valle che, a seconda del tipo di stimolo, possono condurre all’apoptosi o alla sopravvivenza della cellula. Abbiamo caratterizzato la struttura secondaria e terziaria della proteina in funzione della temperatura utilizzando spettroscopia nell’UV in cuvetta (in particolare Dicroismo Circolare, fluorescenza statica e dinamica), mentre la struttura quaternaria e lo stato di aggregazione della proteina sono stati studiati effettuando esperimenti di light scattering. La stabilità della proteina e le transizioni di unfolding/refolding sono state studiate in dettaglio utilizzando alta pressione, agenti denaturanti chimici (guanidina) e temperatura. Abbiamo scoperto che in soluzione, a temperatura ambiente, la proteina esibisce una struttura oligomerica compatibile con quella trovata nel cristallo, in particolare quest’ultima si è dimostrata essere un trimero costituito da tre identiche sub unità. Abbiamo anche dimostrato che la stabilità della struttura quaternaria di TRAF2dipende strettamente dalla presenza di 3 segmenti di α-elica che sono tenuti insieme nella proteina nativa foldata. Abbiamo anche condotto uno studio per monitorare l’interazione di TRAF2 con le membrane modello (GUV) poiché è stata precedentemente avanzata l’ipotesi che i lipid rafts delle membrane cellulari svolgessero un ruolo cruciale nella funzione di TRAF2. Siamo stati in grado di stabilire utilizzando tecniche di spettroscopia a correlazione di fluorescenza (FCS), il coefficiente di diffusione della proteina all’interno di diverse tipologie di membrane, sia sintetiche, sia estratte da tessuti reali. Abbiamo inoltre utilizzato la Generalized Polarization e l’analisi dei fasori spettrali del Laurdan per studiare come TRAF2 influenza la fluidità delle membrane. I nostri risultati dimostrano che TRAF2 esercita una effetto meccanico sul doppio strato lipidico in quanto la sua aggiunta alle GUV induce la formazione di vescicole intraluminali.