Studio biochimico e funzionale delle transglutaminasi epidermiche

Transglutaminases (TGases) are a widely distribuited group of enzymes that catalyse the post-translational modification of proteins by the formation of isopeptide bonds. This occurs either through protein cross-linking via ε- (γ-glutamil)lysine bonds or through incorporation of primary amines at selected peptide-bound glutamine residues. The cross-linked products, often of high molecular mass, are highly resistant to mechanical challenge and proteolytic degradation, and their accumulation is found in a number of tissues and processes where such properties are important, including skin, hair, blood clotting and wound healing. In common with many other important cellular functions found in mammalian cells, TGases require the binding of Ca 2+ for their activity, but at concentrations normally in the supraphysiological, not the physiological, range associated with most intracellular processes. In mammals, nine distinct TGase isoenzymes have been identified at the genomic level; however, only seven have so far been isolated and characterized at the protein level, after purification either from natural sources or as recombinant proteins. The aim of this thesis was to study in depth the role of TGase1, TGase2 and TGase5 during epidermal differentiation. Knock-out animals for TGase1, TGase2 and TGase1&TGase2 have been available in our laboratory for some time. A phenotypic analysis of 18,5 day embryos showed that the lack of the TGase1 gene resulted in mice with abnormal keratinisation. In their stratum corneum, degradation of nuclei and keratohyalin F-granules was incomplete and cell envelope assembly was defective and these mice die within 4-5h after birth. Instead, by our confocal studies we were able to observe that the lack of TGase2 gene didn’t lead to lethality or abnormalities at the epidermal level. In the double knock-out too, we didn’t see any epidermal phenotype. By a deeper study of corneocyte structure and the ability of cross-linking activity of culture keratinocytes, we could confirm that the lack of TGase2 gene does not influence the structure or aminoacidic composition of corneocytes, or cross-linking activity between structural proteins during epidermal differentiation. Considering the ubiquitous nature of TGase2 enzyme expression we also studied several organs during different embrional development stages highlighting an increase of the phenotype in the brain of TG1&TG2KO embryos at 15,5 days. Probably in the double knock-out mouse brain, the lack of a compensatory activity furnished by other family members leads to an abnormal phenotype at the level of “Cerebral Aqueduct” and of the “Fourth ventricle”. We can therefore hypothesize a cooperation between TGase1 and TGase2 in brain development. TGase5 is one of the least characterized members of transglutaminase family. Previous biochemical studies indicated the enzyme is active, and kinetic and in vitro cross-linking experiments showed that it’s very efficient in using specific epidermal substrates, such as loricrin, involucrin and SPR3. These data suggest that the enzyme could play a role in the early stages of cornified cell envelope formation during epidermal differentiation. We analysed TGase5 expression in the hair follicle, comparing with TGase 1 and 3, and their substrate, involucrin. TGase 5 distribution in the proximal part of the follicle was very similar to that of involucrin. Longitudinal and transverse sections of proximal part of hair follicles were analysed by indirect immnofluorescence, and we confirmed that TGase 5 and involucrin expression patterns were perfectly identical. These results suggested that TGase5 could play an important role during all the hair IRS keratinisation process. Studies of enzymatic activity regulation showed that TGase5 was regulated in vitro by nucleotide GTP/ATP. In particular, the nucleotides were able to inhibit transglutaminase activity of TGase5 in a dose-dependent manner, and this inhibition was reverted by calcium. We showed that TGase5 binds directly to GTP, and is able to hydrolyse it, at least in vitro. Then, we showed that TGase5 could be proteolytically activated, similar to other epidermal transglutaminase (TGase 1 and 3). In fact, in the recombinant system we used to produce TGase5 and in HEK-293 cells, we found an active 50 kDa-fragment corresponding to TGase 5 N-terminus, and a C-terminal 30 kDa-fragment that co-purified with full-length enzyme. Finally we analyzed the involvment of the TGM5 gene in Acral Peeling Skin Syndrome. This is an autosomal recessive genodermatosis characterized by shedding of the outer epidermis. In the acral form, (APSS), the dorsa of hands and feet are predominantly affected. Ultrastructural analysis revealed tissue separation at the junction between granular cells and the stratum corneum in the outer epidermis. Two homozygous missense mutations T109M and G113C were found in TGM5, encoding TGase5, in all affected persons in two unrelated families. An established in vitro biochemical crosslinking assay revealed that although T109M is not pathogenic, G113C completely abolishes TGase5 activity. Our data demonstrate that TGase5 is a multifunctional enzyme with a complex set of biological functions, which are not restricted to the epidermis. The different mechanisms of posttranslational regulatory control indicate that, inside the cell, TGase5 expression and activity must be carefully regulated.

Le transglutaminasi (TGs) rappresentano una famiglia di enzimi funzionalmente e strutturalmente correlati che catalizzano la reazione di trasferimento, Ca2+-dipendente, di un gruppo acilico tra il gruppo γcarbossiamidico dei residui di glutammina e il gruppo amminico di varie ammine primarie. Quando la reazione di trasferimento di un gruppo acilico riguarda un gruppo γ-carbossiammidico di glutammina ed un gruppo εamminico di lisina, presenti su due proteine diverse, si forma un legame isopeptidico ε-(γ-glutamil)lisina. In questo modo, le transglutaminasi catalizzano la formazione di legami crociati (cross-linking), promuovendo la formazione di aggregati di proteine ad alto peso molecolare, tali aggregati sono stabili e molto insolubili. Nell’uomo sono stati descritti nove membri appartenenti alla famiglia delle TGs, tra questi quattro, la TGasi1, la TGasi2, laTGasi3 e la TGasi5, sono espressi nell’epidermide. Lo scopo del mio lavoro in questi tre anni di dottorato è stato quello di studiare il ruolo delle TGasi1, TGasi2 e TGasi5 nel differenziamento epidermico. Inizialmente abbiamo effettuato la caratterizzazione del fenotipo epidermico del topo KO per la TGasi1 e TGasi2 per osservare se la mancanza della TGasi2 determinasse un aggravamento del fenotipo, gia descritto nel topo KO per la TGasi1. I topi KO per la TG1 e TG2 sono stati generati nel nostro laboratorio risultando letali come i topi KO per la TGasi1. Attraverso analisi di microscopia confocale abbiamo analizzato l’espressione dei marker del differenziamento, e abbiamo osservato che l’epidermide dei topi TGasi1 e TGasi2 KO e’ molto simile a quella dei TGasi1 KO. L’analisi biochimica degli estratti dell’ involucro corneo degli animali con diverso genotipo, mostra che l’assenza della TG2 non altera il fenotipo epidermico almeno in condizioni normali. Avendo considerato la modalità di espressione ubiquitaria della TGasi2, lo studio del fenotipo è stato effettuato anche per i diversi organi durante le diverse fasi di sviluppo embrionale, evidenziando un aggravarsi del fenotipo nel cervello dell’embrione TG1&TG2KO. Probabilmente nel doppio knock-out, la mancanza di compensazione fornita da altri membri della famiglia, determina un fenotipo anomalo a livello del Acquedotto di Silvio e del quarto ventricolo. Si può quindi ipotizzare una cooperazione nello sviluppo di alcune regioni del cervello tra TGasi1 e TGasi2. Successivamente abbiamo svolto uno studio biochimico e funzionale della TGasi5. La TGasi5 è uno degli ultimi membri della famiglia delle TGs ad essere stata identificata e parzialmente caratterizzata. Abbiamo approfondito in particolare lo studio dell’espressione della TGasi5 in una delle appendici della pelle, il bulbo pilifero, confrontandola con l’espressione della TGasi1, della TGasi3 e di un loro substrato, l’involucrina. I risultati ottenuti sullo studio dell’espressione delle transglutaminasi nel bulbo pilifero umano in crescita indicano che la TGasi1 e la TGasi5 potrebbero avere un ruolo complementare e sequenziale nella formazione dell’involucro corneo del pelo, come dimostra la loro distribuzione in tutta l’unità pelo-sebacea. Studi biochimici hanno dimostrato che l’enzima utilizza con buona efficienza i substrati specifici dell’epidermide, come la loricrina, le SPRs e l’involucrina. Questi dati, generati in vitro, suggeriscono che la TGasi5 sia coinvolta nell’assemblaggio dell’involucro corneo, durante il differenziamento epidermico. Abbiamo osservato che la TGasi5 è proteoliticamente attivata ed abbiamo identificato la sequenza del sito di taglio. L’attivazione proteolitica determina infatti la formazione di un frammento N-terminale del peso di circa 50 kDa e la presenza di un frammento C-terminale di 30 kDa. Studi biochimici condotti sulla TGasi5 ricombinante hanno mostrato che la maggior parte dell’attività enzimatica riscontrata è dovuta al frammento di 50 kDa. Abbiamo inoltre dimostrato che, in modo analogo alla TGasi3 e alla TGasi2, l’attività della TGasi5 e’ regolata negativamente da nucleotidi, quali GTP, GDP e ATP. Ritenendo la TGasi5 importante nel differenziamento epidermico, abbiamo analizzato il suo coinvolgimento nella malattia genetica “Acral Peeling Skin Sindrome” (APSS). APSS e’ una malattia ereditata con modalità autosomica recessiva, caratterizzata dalla frattura e rottura nello strato più esterno dell’epidermide del dorso delle mani e dei piedi. In collaborazione con il Dr McLean (Dundee,UK), abbiamo identificato in pazienti affetti da APSS, due mutazioni che codificano per T109M e G113C. Attraverso studi di biochimica abbiamo dimostrato che una sola delle due mutazioni, la G113C, e’ responsabile dell’attivazione dell’enzima TGasi5 ed e’ quindi alla base della patogenesi della APSS. Possiamo quindi ipotizzare che oltre ad avere un ruolo nel differenziamento epidermico, evidenziato dal suo coinvolgimento in malattie che provocano danni negli strati in differenziamento, la TGasi5 potrebbe partecipare anche all’omeostasi del pelo umano.