Catterizzazione della dna topoisomerasi I umana e della sua interazione con il farmaco antitumorale camptotecina

Eukaryotic topoisomerase I is a monomeric enzyme that catalyze the relaxation of supercoiled DNA during important processes including DNA replication, transcription, recombination and chromosome condensation. Human topoisomerase I is composed of 765 aminoacids and the crystal structure of the Nterminal truncated protein together with proteolytic experiments have shown that the enzyme is composed of four different domains: N-terminal domain (residues 1-214), core domain (residues 215-635), linker domain (residues 636-712) and C-terminal domain (residues 713-765), which includes the catalytic tyrosine 723. The catalytic cycle of the topoisomerase I may be divided into a series of steps involving: non-covalent binding to DNA, cleavage of the single strand with generation of a covalent 3’phosphotyrosyl bond and a free 5’-hydroxil, controlled rotation of the DNA scissile strand, religation and DNA release. During these steps the enzyme goes through large conformational variations without any need for energy cofactors, from an “open” structure that allows the DNA binding, to the “close” conformations observed by X-ray diffraction in which the enzyme completely ambraces the DNA. Topoisomerase I is the sole molecular target for the camptothecin class of anticancer drugs, which are used in the treatment of many types of cancers including colorectal and ovarian cancer. Camptothecin and its derivatives bind to the transient covalent topoisomerase I–DNA complex in a way that slows the religation step and therefore increases the lifetime of the covalent complex. Numerous studies suggest that during S phase, the collision of the advancing replication forks with these drug-stabilized cleavable complexes produced double-stranded DNA breaks, an inhibition of DNA synthesis, cell cycle arrest in G2 and cell death. A CPT-like behaviour was proposed for the threonine 718 to alanine mutant. This mutant when expressed in Saccaromyces cerevisiae exhibits a dramatic reduction in cell viability, enhancing the stability of the cleavable complex, with a mechanism similar to the actions of CPT. The biochemical characterization of this mutant has been described in this thesis and the results presented show that at 150 mM KCl the Thr718Ala mutant has a DNA relaxation rate lower than the wild-type enzyme. The relaxation experiment shows that the decreased relaxation efficiency of the mutant, when compared to the wild-type, is independent of the DNA/enzyme ratio. This result excludes that the difference in DNA relaxation between the two proteins can be ascribed to the enzyme association/dissociation rate. At physiological ionic strength the wild-type and mutated enzyme have an identical equilibrium, as well as an identical religation rate indicating that at this ionic strength the reduced relaxation rate of the Thr718Ala mutant is not due to a variation of the cleavage or religation rate. This imply that the main effect of the single Thr718Ala mutation is associated to the rotation step of the catalysis. MD simulation has confirmed this result showing how the mutation of a residue, Thr718, which is relatively close to the catalytic site, can influence the strand rotation step of the catalysis. The plot of the RMSF in fact indicates that in proximity of the mutation site the two enzymes have identical fluctuations and that the main differences are localized in the linker domain and in core subdomain II that are supposed to be involved in the DNA strand rotation. The equilibria between the different forms of the topotecan anticancer drug have been studied at moderately acidic and physiological pH by an integrated quantum-mechanical and experimental (UV-vis) approach. The ultraviolet –visible topotecan spectrum, recorded at moderately acidic pH, is accurately reproduced only by TD-DFT computations including solvent effects. Comparison of the experimental and calculated bands of the UV-vis spectrum at physiological pH indicates the presence of the equilibrium among different forms that is tuned by the microenvironment embedding the drug. Comparison of the computed and experimental absorption spectrum allows us to identify unequivocal spectroscopic signatures for the different topotecan forms. Moreover the preliminary work on the expression conditions for the 70KDa enzyme (Topo-70) in insect cells, and the expression and purification conditions of N and C-terminal domains of the protein in bacterial system has been described. Problems found during the experimental set-up and relative solutions are discussed.

La topoisomerasi I eucariotica è un enzima monomerico, il quale catalizza il rilassamento del DNA durante importanti processi cellulari, che comprendono la replicazione, la trascrizione, la ricombinazione e la condensazione cromosomica. La topoisomerasi I umana è composta di 765 amminoacidi e la struttura cristallografica della proteina priva del dominio N-terminale, insieme ad esperimenti di proteolisi hanno mostrato che la proteina è composta di quattro differenti domini: il dominio N-terminale (residui 1-214), il dominio core (residui 215635), il dominio linker (residui 636-712) e il dominio C-terminale (residui 713-765), che contiene la tirosina catalitica in posizione 723. Il ciclo catalitico della topoisomerasi I può essere diviso in una serie di passaggi, che comprendono il legame non covalente al DNA, il taglio di un singolo filamento, con la formazione di un legame covalente 3’fosfotirosinico e un’estremità 5’ libera, la rotazione controllata del filamento scissile di DNA, la risaldatura del filamento e il rilascio del substrato. La topoisomerasi I è il solo bersaglio cellulare di farmaci antitumorali della famiglia delle camptotecine, usati in molti tipi di tumori, quali il tumore ovarico e colorettale. La camptotecina ed i suoi derivati legano il complesso covalente DNA-enzima rallentando la fase di risaldatura del filamento e incrementando il tempo di vita del complesso stesso. Numerosi studi hanno suggerito che durante la fase S del ciclo cellulare la collisione delle forche replicative con i complessi covalenti stabilizzati dal farmaco, producono: rotture della doppia elica del DNA, un’inibizione della sintesi di DNA, arresto del ciclo cellulare in G2 e morte cellulare. Un comportamento simile alle camptotecine è stato proposto per il mutante Thr718Ala, della topoisomerasi I umana. Questo mutante quando espresso in lievito Saccaromyces cerevisiae determina una drammatica riduzione della vitalità cellulare, aumentando la stabilità del complesso covalente, con un meccanismo simile all’azione delle CPT. La caratterizzazione biochimica di questo mutante è stata descritta in questa tesi ed i risultati riportati dimostrano che, a 150 mM KCl, il mutante Thr718Ala ha una velocità di rilassamento del DNA più bassa dell’enzima selvatico. Gli esperimenti di rilassamento dimostrano che la diminuita efficienza del mutante, rispetto l’enzima selvatico, è indipendente dal rapporto DNA/enzima. Questo risultato esclude che la differenza di rilassamento del DNA tra le due proteine possa dipendere dalle velocità dissociazione/dissociazione. A forza ionica fisiologica l’enzima mutato e il selvatico hanno un identico equilibrio, come anche un’identica velocità di taglio e risaldatura del filamento. Questo implica che il principale effetto della singola mutazione Thr718Ala è associata con lo “step” di rotazione del filamento. Simulazioni di dinamica molecolare hanno confermato questo risultato, mostrando come la mutazione di un residuo prossimo al sito attivo può influenzare lo step catalitico di rotazione del filamento. L’analisi delle fluttuazioni quadratiche medie dei residui indica che, in prossimità del sito di mutazione, i due enzimi hanno identiche fluttuazioni e che le loro principali differenze sono localizzate nel dominio linker e nel subdominio II del core, coinvolti nella rotazione del filamento del DNA. L’equilibrio delle diverse forme del farmaco antitumorale topotecano in soluzione è stato studiato a pH moderatamente acido e fisiologico attraverso un approccio integrato sperimentale e quanto-meccanico. Lo spettro del topotecano nella regione dell’UV-visibile a pH moderatamente acido è accuratamente riprodotto solo dalle computazioni TD-DFT, che includono gli effetti del solvente. La comparazione delle bande spettrali sperimentali e calcolate, dello spettro UV-visibile a pH fisiologico, indica la presenza di un equilibrio tra le diverse forme, guidato dal microambiente del farmaco. La comparazione dello spettro di assorbimento sperimentale e calcolato ci ha permesso di identificare caratteri spettroscopici inequivocabili per le diverse forme del topotecano. E’ stato inoltre descritto il lavoro preliminare eseguito per determinare le condizioni di espressione dell’enzima di 70KDa, in cellule d’insetto e le condizioni di espressione e purificazione dei domini N e Cterminale della proteina nel sistema batterico.