Studio delle proprietà strutturali e funzionali della dna topoisomerasi i umana attraverso simulazioni di dinamica molecolare classica

Human DNA topoisomerase I relaxes supercoiled DNA through the formation of a covalent intermediate in which the active-site tyrosine is transiently bound to the cleaved DNA strand. The structural and dynamical properties of various forms of this enzyme, both in complex with a 22bp DNA duplex and alone, have been investigated by Molecular Dynamics simulations. In detail, the simulations involved the following forms of the enzyme: the complexes DNA-topo58/6.3, DNA-topo70, DNA-topoT718A and the enzyme in the absence of DNA. The topo58/6.3 form of human topoisomerase I lacks the N-terminal and the linker domain while the topo70 form lacks only the N-terminal domain. The analyses on the DNA-topo58/6.3 complex showed a great number of correlated movements of core subdomain I and II residues, and a central role for helix 5 in the protein-DNA communication, in particular with the scissile strand downstream of the cleavage site. The comparison between topo70-DNA and topo58/6.3-DNA complexes Furthermore, the influence of the N-terminal residues 203–214 and the linker domain on motions in the human topoisomerase I-DNA complex has been investigated by comparing the molecular dynamics simulations of the system with (topo70) or without (topo58/6.3) these regions. Topo58/6.3 is found to fluctuate more than topo70, indicating that the presence of the N-terminal residues and the linker domain dampens the core and C-terminal fluctuations. The MD simulation carried out on the T718A mutant enzyme complexed with its DNA substrate indicates that the single mutation confers a different dynamical behaviour compared to the wild-type enzyme. Interestingly, no changes are observed in the proximity of the mutation site, while a different flexibility is detected in regions contacting the DNA scissile strand, such as the linker and the V-shaped α-helices. The simulation results indicate a direct communication between the mutation site and regions located relatively far away, such as the linker domain, that, with their altered flexibility, confer a reduced DNA relaxation efficiency. The structural and dynamical properties of the human topoisomerase I, have also been investigated comparing the molecular dynamics simulations of the system with and without DNA. The simulations show that a charge perturbation of the salt bridge and of the hydrogen bonds present on the lips, induces the opening of the protein “clamp” and allows to observe, for the first time, that the two principal lobes of the enzyme can separate from each other to open the “clamp”. Furthermore the simulations allows to localize a hinge around which the protein lobes rotate during the opening. The stability shown by the open conformation of the enzyme suggests that we are sampling the most probably conformation, that corresponds to the open structure of the enzyme in the absence of its substrate.

La DNA topoisomerasi I umana rilassa il DNA superavvolto attraverso la formazione di un intermedio covalente nel quale la tirosina del sito attivo è legata in maniera transiente al filamento di DNA scissile. Le proprietà strutturali e dinamiche di varie forme di questo enzima, sia in complesso con 22 coppie di basi di DNA che in forma libera, sono state studiate tramite simulazioni di Dinamica Molecolare classica. In particolare sono stati simulati i seguenti sistemi: i complessi DNA-topo58/6.3, topo70-DNA, topoT718A-DNA e l’enzima in assenza di DNA. La forma ricostituita topo58/6.3 della topoisomerasi I umana, è priva del dominio N-terminale e del dominio linker, mentre la forma topo70 è priva solamente del dominio N-terminale. Le analisi sul complesso DNA-topo58/6.3, hanno evidenziato un gran numero di moti correlati trai i residui dei subdomini del core I e II ed un ruolo chiave dell’elica 5 nella comunicazione proteina-DNA, in particolare con lo strand scissile, a valle del sito di taglio. Inoltre sono state studiate l’influenza del dominio linker e dei residui 203-214 all’N-terminale sui movimenti proteici del complesso enzima-DNA, attraverso il paragone delle simulazioni del sistema in presenza (topo70) o in assenza (topo58/6.3) di queste regioni. Topo58/6.3 presenta delle fluttuazioni maggiori rispetto a topo70, ad indicare che la presenza del dominio linker e dei residui N-terminali, attenuano le fluttuazioni dei domini core e C-terminale. La simulazione di del mutante Thr718Ala della topoisomerasi I in complesso con il DNA, mostra come la singola mutazione conferisca un comportamento dinamico differente all’enzima rispetto al wild-type. Da notare che le differenze non si osservano in prossimità del sito attivo, mentre si individua una diversa flessibilità nelle regioni della proteina che contattano lo strand scissile del DNA, come il linker e le “V-shaped” α-eliche. I risultati della simulazione indicano una comunicazione diretta tra il sito di mutazione e regioni che si trovano relativamente distanti, come il dominio linker, che, con la sua alterata flessibilità, conferisce all’enzima una ridotta efficienza nel rilassamento del substrato desossi-ribo-nucleo-proteico. Le proprietà dinamiche e strutturali della DNA topoisomerasi I umana sono state studiate anche attraverso il paragone del sistema con e senza DNA. Le simulazioni mostrano che la perturbazione di carica introdotta all’interfaccia delle lips per rimuovere il ponte salino e le interazioni elettrostatiche deboli come i legami a idrogeno, induce l’apertura della clamp (morsa) proteica e permette di osservare, per la prima volta, la separazione dei due lobi principali dell’enzima e la conseguente apertura dell’enzima. Inoltre la simulazioni permettono di identificare un “perno” attorno al quale i due lobi dell’enzima ruotano durante il movimento d’apertura. Infine, la grande stabilità esibita dalla conformazione aperta dell’enzima, suggerisce quest’ultima come una delle conformazioni più probabili dell’enzima in assenza di DNA.