Regulation of endocannabinoid system by lipid rafts along the neuroimmune axis

Anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) and the other endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) bind to and activate two G protein-coupled receptors (GPCR), namely type-1 (CB1R) and type-2 (CB2R) cannabinoid receptors. CB1R are localized mainly in the central nervous system, but are also expressed in peripheral tissues like immune cells. Conversely CB2R are predominantly expressed peripherally, but they are also present in the brain. Therefore, activation of CB1 or CB2 receptors by AEA or 2-AG has many central and peripheral effects. These actions are controlled through not yet fully characterized cellular mechanisms, that regulate the release of endocannabinoids from membrane precursors, their uptake by cells, and finally their intracellular disposal. The key agent in AEA synthesis is the N-acylphosphatidylethanolamines (NAPE)-hydrolyzing phospholipase D (NAPE-PLD), whereas degradation occurs through an AEA membrane transporter (AMT), and a fatty acid amide hydrolase (FAAH). Besides CB receptors, AEA binds also to type 1 vanilloid receptors (now called transient receptor potential channel vanilloid receptor subunit 1, TRPV1). On the other hand, 2-AG is released from membrane lipids by means of a sn-1-specific diacylglycerol lipase (DAGL), and is hydrolyzed by a specific monoacylglycerol lipase (MAGL). The transport of 2-AG through the cellular membrane has been shown to be saturable and energyindependent, and might occur through the same AMT that transports AEA. Altogether AEA and 2-AG, with other congeners, the proteins that bind, transport, synthesize and hydrolyze these lipids, form the “endocannabinoid system”. Lipid rafts are subdomains of the plasma membrane that contain high concentrations of cholesterol and glycosphingolipids, and are well-known modulators of the activity of a number of GPCR. In fact, they modulate signaling and membrane trafficking in many cell types. The growing evidence suggesting that lipid rafts might modulate the endocannabinoid signaling prompted us to investigate also the possible effect of lipid rafts integrity on CB receptors, on AEA metabolism in neuronal and immune cells and on the proteins that synthesize, transport and degrade 2-AG. We have used the methyl--cyclodextrin (MCD), a membrane cholesterol depletor that is widely used to disrupt the integrity of lipid rafts. We have chosen rat C6 glioma cells, because they have a well characterized endocannabinoid system. We extended the study to human CHP100 neuroblastoma cells, which have the same ability as C6 cells to metabolize AEA, but are devoid of CB1R and hence are more sensitive to the pro-apoptotic activity of AEA. We did not further extend this study to 2-AG and the enzymes that degrade and synthesize it, because 2-AG does not have pro-apoptotic activity toward C6 cells or CHP100 cells, in keeping with the observation that it does not activate TRPV1 receptors. Furthermore, we have chosen human DAUDI leukemia cells, because they have active AMT and FAAH, and express functional CB2R. On the other hand, in DAUDI cells lipid rafts regulate important functions like exosome secretion, or growth arrest induced by antitumor drugs. In addition, we checked for the first time the effect of membrane cholesterol depletion or enrichment on 2-AG metabolism in C6 cells and DAUDI cells. In conclusion, this study monitor the effect of lipid rafts integrity on all the major proteins that bind and metabolize AEA and 2-AG, both in neuronal and immune cells. The results point out that CB1R and endocannabinoid transporters are probably localized within lipid rafts, at variace with CB2R and the other proteins of the endocannabinoid system.

L’anandamide (arachidonoiletanolammide, AEA), insieme con l’altro endocannabinoide 2arachidonoilglicerolo (2-AG), lega ed attiva i due recettori accoppiati a proteine G inibitorie, (GPCR), chiamati recettori dei cannabinoidi di tipo-1 (CB1R) e di tipo-2 (CB2R). I CB1R sono localizzati principalmente nel sistema nervoso centrale, ma sono anche espressi in tessuti periferici come le cellule immunitarie. Mentre i CB2R sono maggiormente espressi a livello periferico, ma sono anche presenti nel cervello. Quindi l’attivazione dei recettori CB1 o CB2 da parte dell’AEA e del 2-AG ha molti effetti sia a livello centrale che periferico. Queste azioni sono controllate attraverso un non ancora caratterizzato meccanismo cellulare, che regola il rilascio degli endocannabinoidi da precursori di membrana, il loro trasporto all’interno delle cellule, ed infine la loro eliminazione. L’agente chiave nella sintesi dell’AEA è la N-acilfosfatidiletanolammine (NAPE)-fosfolipasi D (NAPE-PLD), mentre la sua degradazione avviene attraverso un trasportatore di membrana per AEA (AMT), ed una fatty acid amide hydrolase (FAAH). Oltre i recettori CB, l’AEA lega anche il recettore dei vanilloidi di tipo 1 (TRPV1). Il 2-AG è invece rilasciato da lipidi di membrana per azione di una lipasi specifica, sn-1-diacilglicerolo (DAGL), ed è idrolizzato da una specifica monoacilglicerolo lipasi (MAGL). E’ stato dimostrato che il trasporto del 2-AG attraverso la membrana cellulare è saturabile ed energia-indipendente e che può occorrere attraverso lo stesso trasportatore dell’AEA. L’AEA ed il 2-AG, con altri congeneri, le proteine che legano, trasportano, sintetizzano ed idrolizzano questi lipidi formano il “sistema endocannabinoide”. I lipid rafts sono subdomini della membrana plasmatica che contengono alte concentrazioni di colesterolo e di sfingolipidi, e sono ben conosciuti modulatori dell’attivitità di un numero di GPCR. Infatti, essi modulano il segnale ed il “trafficking” in molti tipi cellulari. La crescente evidenza che i lipid rafts possono modulare il segnale degli endocannabinoidi ci ha spinto ad investigare il possibile effetto della loro integrità sui recettori CB, sul metabolismo dell’AEA e del 2-AG in cellule neuronali e del sistema immunitario. A tale scopo abbiamo utilizzato la metil-β-ciclo destrina (MCD), un depletore del colesterolo, un composto largamente utilizzato per distruggere l’integrità dei lipid rafts. Abbiamo utilizzato le cellule di glioma di ratto C6, perché esse hanno un ben caratterizzato sistema endocannabinoide. Abbiamo poi esteso lo studio alla linea cellulare di neuroblastoma umano CHP100, la quale ha la stessa abilità delle cellule C6 di metabolizzare l’AEA, ma sono prive del CB1R e quindi sono più sensibili all’attività pro-apoptotica dell’AEA. Abbiamo inoltre esteso lo studio agli enzimi che degradano e sintetizzano il 2-AG. Inoltre, abbiamo studiato la linea cellulare umana DAUDI, perché possiede l’AMT e l’enzima FAAH ed esprime un CB2R funzionale. Le cellule DAUDI, inoltre, regolano importanti funzione in cui sono coinvolti i lipid rafts, come la secrezione di esosomi e l’arresto della crescita indotta dai farmaci antitumorali. Inoltre abbiamo valutato l’effetto della deplezione e dell’arrichimento di colesterolo sul metabolismo degli endocannabinoidi. In conclusione, questo studio ha monitorato l’effetto dell’integrità dei lipid rafts sulle principali proteine che legano e metabolizzano l’AEA ed il 2-AG, sia in cellule neuronali che in cellule del sistema immunitario. Tale studio indica che il CB1R ed il trasportatore degli endocannabinoidi sono probabilmente localizzati all’interno dei lipid rafts a differenza del CB2R e delle altre proteine che compongono il sistema endocannabinoide.