Characterization of human topoisomerase IB N-terminal domain and effect of cEPA on the activity of human and L. Donovani Topoisomerase IB

DNA topoisomerases are enzymes that catalyze the relaxation of supercoiled DNA during important processes including DNA replication, transcription, recombination and chromosome segregation. In this work I have investigated the structural properties of the N-terminal domain of the human enzyme and I have compared the effect of conjugated eicosapentaenoic acid (cEPA) on the activity of human and L. donovani topoisomerase. The 3D structure of the human enzyme has been solved in absence of the N-terminal domain and so nothing is known on its structural feature. In this thesis, the N-terminal domain of human topoisomerase IB has been expressed, purified and characterized by spectroscopic techniques. CD spectra as a function of concentration and pH indicate that the domain does not possess any defined secondary structure. The protein is probably in a natively unfolded state since its denaturation curve is indicative of a non-cooperative transition. Evidence of a partially folded structure comes from the fluorescence spectrum of ANS, whose intensity increase in presence of the domain. Indication of a partial structural arrangement of the domain comes also from the endogenous fluorescence of tryptophans that is centred at 350 nm in the native and shifts to 354 nm in the fully denaturated protein. Interestingly despite the poor degree of structural organization, as also confirmed by a predictive approach, the domain efficiently binds DNA, suggesting that the absence of a defined 3D structure has a functional meaning that permits the domain to be available for the interaction with different molecular partners. Human topoisomerase has been shown to be inhibited by several compounds and among these the best characterized one is camptothecin that, being an efficient stabilizer of the topoisomerase cleavable complex, is widely used as antitumor agent. Conjugated eicosapentaenoic acid (cEPA) has been recently found to have antitumor effects, ascribed to its ability to inhibit DNA topoisomerases and DNA polymerases. Here it is shown that cEPA inhibits the catalytic activity of human topoisomerase I, but unlike camptothecin it does not stabilize the cleavable complex, indicating a different mechanism of action. cEPA inhibits topoisomerase by impeding the catalytic cleavage of the DNA substrate as demonstrated using specific oligonucleotide substrates, and prevents the stabilization of the cleavable complex by camptothecin. Preincubation of the inhibitor with the enzyme is required to obtain complete inhibition. Molecular docking simulations indicate that the preferred cEPA binding site is proximal to the active site with the carboxylic group strongly interacting with the positively charged K443 and K587. Taken together the results indicate that cEPA does not prevent DNA binding but inhibits DNA cleavage, binding in a region close to the topoisomerase active site. The effect of cEPA on L. donovani topoisomerase has been also investigated showing an inhibitory efficiency higher than that displayed for the corresponding human enzyme. Moreover cEPA shows a strong antiprotozoal activity against L. donovani promastigotes ( EC50= 22.7 μg/ml) whilst it has no effect against murine macrophages ( IC50 > 600 μg/ml). Taken together the results indicate that L. donovani topoisomerase I can be considered an interesting molecular target and that conjugated eicosapentaenoic acid can be taken in consideration as a possible lead compound against leishmaniasis.

Le DNA topoisomerasi sono enzimi che catalizzano il rilassamento del DNA durante importanti processi che includono la replicazione del DNA, la trascrizione, la ricombinazione e la segregazione cromosomica. In questo progetto ho analizzato le proprietà strutturali del dominio N-terminale dello enzima umano e in secondo momento ho comparato l’effetto dell’Acido eicosapentaenoico coniugato (cEPA) sull’attività della topoisomerasi umana e di quella appartenente alla L. donovani. La struttura tridimensionale dell’enzima umano è stata risolta in assenza del dominio N-terminale e quindi le sue caratteristiche strutturali sono ad oggi sconosciute. Durante lo svolgimento di questa tesi di dottorato il dominio N-terminale della topoisomerasi IB è stato espresso, purificato e caratterizzato attraverso tecniche spettroscopiche. Gli spettri CD ottenuti in funzione della concentrazione e del pH indicano che il dominio non presenta struttura secondaria. La proteina è probabilmente in uno stato detto “natively unfolded” dato anche che la sua curva di denaturazione è indicativa di una trnsizione non-cooperativa. Prove di una struttura parzialmente foldata vengono dallo spettro di fluorescenza dell’ ANS, la cui intensità aumenta in presenza del dominio. Un’indicazione di struttura parzialmente organizzata del dominio viene anche dalla fluorescenza intrinseca dei triptofani che è centrata a 350 nm nello stato nativo e slitta a 354 nm nella proteina completamente denaturata. Nonostante il basso grado di struttura, confermato anche da un’analisi bioinformatica, il dominio lega con alta efficienza il DNA, suggerendo che l’assenza di una struttura definita ha il significato funzionale di permettere al dominio di essere disponibile per l’interazione con diversi partners molecolari. La topoisomerasi umana è inibita da numerosi composti e tra questi il meglio caratterizzato è la camptotecina, che essendo un efficiente stabilizzatore dei “topoisomerase cleavable complex”, è stata largamente utilizzata come agente antitumorale. L’acido eicosapentaenoico coniugato (cEPA) è stato visto avere proprietà antitumorali che sono state ascritte alla sua capacità di inibire le DNA topoisomerasi e DNA polimerasi. In questo studio è stato dimostrato che il cEPA inibisce l’ attività catalitica della topoisomerasi IB umana, ma diversamente dalla camptotecina non stabilizza I “cleavable complex”, indicando un differente meccanismo di azione. Il cEPA inibisce la topoisomerasi impedendo il cleavage del DNA come dimostrato usando oligonucleotidi specifici come substrati, ed è in grado di prevenire la stabilizzazione dei “cleavable complex” da parte della camptotecina. La Preincubazione dell’inibitore con l’enzima è necessaria per ottenere un’inibizione completa. Tecniche simulative di “Molecular docking” indicano che il sito di legame preferenziale del cEPA è vicino al sito attivo dell’enzima, dove il gruppo carbossilico del cEPA interagisce fortemente con i residui carichi positivamente K443 e K587. Questi risultati indicano che il cEPA non impedisce il legame al DNA ma inibisce il cleavage del DNA, legandosi a una regione vicina al sito attivo della topoisomerasi. Anche l’effetto del cEPA sulla topoisomerasi proveniente da L. donovani è stato studiato dimostrando un efficienza di inibizione più alta di quella per l’enzima umano. Il cEPA mostra anche un’attività contro le cellule promastigoti della L. donovani ( EC50= 22.7 μg/ml) mentre non ha effetto contro i macrofagi murini ( IC50 > 600 μg/ml). risultati indicano che la topoisomerasi I di L. donovani può esssere considerata un interessante target molecolare e che l’acido eicosapentaenoico coniugato (cEPA) può essere preso in considerazione come possibile composto specifico contro la Leishmaniosi.