Role of mitophagy in kaempferol-induced neuroprotection in in vitro models of Parkinson’s Disease

Parkinson Disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by degenerative loss of neurons in the nigrostriatal dopaminergic pathway. So far, although several studies concerning PD have been performed, its aetiology remain still unclear. Familiar or hereditary forms account only for the 5 - 10% of the PD cases, while the remaining 95%, defined idiopathic or sporadic, rely on environmental factors without any certain genetic involvement. Therefore, PD can be considered a complex multifactorial pathology, where genetic background should be considered a predisposing factor towards environmental insults such as pesticides and chemicals. By now oxidative stress and mitochondrial injury have been extensively indicated to be involved in PD neuronal demise and are tightly related each other. Moreover the unsuccessful removal of damaged proteins and/or organelles, probably due to the impairment of either the ubiquitin-proteasome system or autophagy, is a further event associated with PD aetio-pathogenesis. In particular, autophagy has been observed to be deregulated in PD brains and in line with this evidence, it has been recently demonstrated that rapamycin, a well-known autophagic inducer, protects from PD toxins and that suppression of basal autophagy causes neurodegeneration in mice. Several therapeutical approaches to slow down PD symptoms have been developed but none of them is currently able to prevent neuronal degeneration. In the last few years the attention of many researchers has been focused on natural-occurring compounds, such as polyphenols, because their use has been suggested to be a promising therapeutic/preventing strategy in oxidative-related diseases. In fact, in addition to their primary antioxidant activity, they could display a wide variety of other biological functions and these properties could be helpful in a complex and multifactorial pathology such as PD. On the basis of this knowledge, this PhD thesis is aimed to elucidate the processes underlying neuroprotection of a natural occurring compound kaempferol in in vitro models of PD. We demonstrate that kaempferol protects SH-SH5Y cells and primary cortical neurons from rotenone toxicity, as a reduction of caspases cleavage and apoptotic nuclei are observed. Reactive oxygen species levels and mitochondrial carbonyls decrease significantly. Mitochondrial network, transmembrane potential and oxygen consumption are also deeply preserved. We demonstrate that the main event responsible for the kaempferol-mediated antiapoptotic and antioxidant effects is the enhancement of mitochondrial turnover by autophagy. Indeed, fluorescence and electron microscopy analyses show an increase of the mitochondrial fission rate and mitochondria-containing autophagosomes. Moreover, the autophagosome-bound microtubule-associated protein light chain-3 increases during kaempferol treatment and chemical/genetic inhibitors of autophagy abolish kaempferol protective effects. Kaempferol induced-autophagy affords protection also toward other mitochondrial toxins (1-methyl-4-phenylpiridinium, paraquat) used to reproduce the typical features of PD, but is inefficient against apoptotic stimuli not directly affecting mitochondria (H2O2, 6-hydroxydopamine, staurosporine). Striatal glutamatergic response of rat brain slices is also preserved by kaempferol, suggesting a more general protection of kaempferol in PD. Overall, this data provide further evidence for kaempferol to be identified as an autophagic enancher with potential therapeutic capacity.

Il Morbo di Parkinson (PD) è una patologia degenerativa del Sistema Nervoso Centrale caratterizzata dalla progressiva perdita dei neuroni dopaminergici del pathway nigrostriatale. Sebbene finora siano stati condotti diversi studi riguardo il PD, la sua eziologia è ancora poco nota. Le forme familiari o ereditarie infatti, rappresentano soltanto il 5-10 % dei casi di PD, mentre il restante 95% è rappresentato dale forme idiopatiche o sporadiche,. Per tale ragione il PD viene considerata una malattia multifattoriale dove l’esposizione a fattori ambientali come pesticidi altri inquinanti gioca un ruolo fondamentale nell’insorgenza della malattia. E’ stato ormai ampiamente dimostrato che lo stress ossidativo e la disfunzione mitocondriale siano fortemente coinvolte nella morte neuronale nel PD. Inoltre, difetti nella rimozione delle proteine danneggiate e/o organelli, dovuto probabilmente a disfunzioni a carico del sistema ubiquitina-proteasoma e dell’autofagia, rappresentano un ulteriore evento coinvolto nell’eziopatogenesi del PD. In particolare, nei cervelli PD sono state osservate alterazioni del processo autofagico e in accordo con tali evidenze è stato recentemente dimostrato che il trattamento con la rapamicina, un noto induttore di autofagia, risulta protettivo contro tossine che causano il PD e che l’inibizione dell’autofagia basale è in grado di causare degenerazione nei topi. Diversi approcci terapeutici sono stati sviluppati finora per rallentare la sintomatologia del PD ma nessuno di questi trattamenti messi a punto è in grado di prevenire o curare la degenerazione neuronale. Negli ultimi anni l’attenzione di molti ricercatori si è focalizzata sullo studio di composti di derivazione naturale, come i polifenoli, in quanto il loro uso farmacologico potrebbe rappresentare un promettente approccio terapeutico/preventivo in patologie correlate allo stress ossidativo. Infatti, in aggiunta alla loro primaria attività antiossidante, è stato dimostrato come tali composti svolgano altre differenti attività biologiche, pertanto il loro utilizzo potrebbe risultare una strategia terapeutica vincente in patologie multifattoriali e complesse come il PD. Sulla base delle nostre conoscenze, questa tesi di Dottorato ha avuto lo scopo di caratterizzare gli effetti neuroprotettivi di un composto di derivazione naturale, il campferolo, in modelli in vitro di PD. Abbiamo dimostrato che il campferolo protegge le cellule SH-SY5Y e i neuroni corticali primari dalla tossicità del rotenone. Inoltre il campferolo è in grado di diminuire significativamente la produzione di specie reattive dell’ossigeno e l accumulo di proteine mitocondriali carbonilate, oltre a preservare la vitalità e la funzionalità della rete mitocondriale. Abbiamo dimostrato che l’evento principale reponsabile degli effetti antiapoptotici e antiossidanti del campferolo è l’induzione dell’aumento del turnover mitocondriale per mezzo dell’autofagia. Infatti analisi in microscopia elettronica e a fluorescenza hanno evidanziato un incremento del tasso di fissione mitocondriale e degli autofagosomi contenenti mitocondri. Inoltre la proteina LC3 (autophagosome-bound microtubule-associated protein light chain-3) aumenta durante il trattamento col campferolo e l’inibizione chimica o genetica del processo autofagico abolisce gli effetti protettivi di tale composto. La protezione mediata dal campferolo è inoltre specifica per altre tossine mitocondriali (1-metil-4-fenilpiridinio, paraquat) usate per riprodurre le tipiche caratteristiche patogenetiche del PD, ma risulta completamente inefficiente contro altri stimuli che non danneggiano il mitocondrio (H2O2, 6-idrossidopamina, staurosporina). L’evidenza inoltre che il campferolo è in grado di preservare l’attività fisiologica dei neuroni striatali in fettine di cervello di ratto, ci suggerisce un protezione più generale di tale composto nel PD. Complessivamente tali evidenze forniscono ulteriori evidenze che il campferolo possa essere identificato come un composto in grado di incrementare il processo autofagico con nuove potenziali applicazioni terapeutiche.