Characterization of new potential SHP2 substrates by a MS-based quantitative approach

Protein tyrosine phosphophatases (PTPs) act in concert and in competition with the more extensively studied family of protein tyrosine kinases (PTKs). Recent findings have led to the emerging recognition that PTPs play specific, active and even dominant roles in setting the levels of tyrosine phosphorylation in cells, thus participating in the regulation of many physiological processes including cell growth, tissue differentiation and inter-cellular communication. However, because of the lack of appropriate methods for the systematic and detailed analysis of cellular function, little is known about PTPs substrate specificity and even in the case of the best characterized members of the family, the few described substrates cannot fully explain the observed physiological and pathological phenotypes. This work aims at shedding light on one of the most controversial tyrosine phosphatase, SHP2, whose physiological functions and involvement in several pathological conditions cannot be fully explained by its known substrates. We used quantitative phosphoproteomic approach to monitor alterations in the global tyrosine phosphorylation of SHP2 mutant mouse embryonic fibroblasts in comparison with their wild-type isogenic counterparts. Three proteins (CDK2, PAXI and MK14) were found to harbor hyperphosphorylated phosphotyrosine sites in mutant cells and were functionally linked to SHP2, as direct or indirect substrates. In particular SHP2-dependent MK14 dephosphorylation can suggest a new mechanism by which SHP2 positively regulates the RAS/MAPK pathway. Additional information about the SHP2 physical interactions were provided by a parallel mass spec analysis of the purified phosphatase complex. The MS-based methods and strategies described here can be generally applied to uncover and characterize substrates and /or interactors of other members of the classical PTP family and have considerable potential to improve the knowledge of the cellular functions carried out by specific phosphatases.

Le Tirosin Fosfatasi agiscono in concerto e in competizione con l’ampiamente caratterizzata famiglia enzimatica delle Tirosin Chinasi. Recenti evidenze sperimentali dimostrano che le Tirosin Fosfatasi svolgono un ruolo attivo, specifico e anche dominante nel determinare i livelli di fosforilazione in tirosina all’interno della cellula, rivelandosi essenziali regolatori di importanti processi fisiologici come crescita cellulare, differenziamento e comunicazione inter-cellulare. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi appropriati per analizzare sistematicamente e dettagliatamente le funzioni cellulari, poco è noto riguardo la specificità di substrato dei membri di questa famiglia enzimatica, e anche nel caso delle fosfatasi più studiate, il ristretto numero di substrati caratterizzati non riesce completamente a chiarire i fenotipi fisiologici e patologici osservati. L’obiettivo del presente lavoro è quello di far luce su una delle più controverse fosfatasi a tirosina, SHP2, le cui funzioni fisiologiche e il coinvolgimento in numerose condizioni patologiche non trovano spiegazione nei pochi substrati conosciuti. La strategia sperimentale consiste in un approccio di fosfoproteomica quantitativa volto a monitorare il profilo globale di fosforilazione in tirosina di fibroblasti embrionali di topo che esprimono una forma mutata di SHP2 e paragonarlo con quello della corrispondente linea cellulare wild-type. Questa analisi ha condotto all’identificazione di tre proteine (CDK2, PAXI e MK14) i cui livelli di fosforilazione in tirosina aumentano drasticamente nella linea cellulare mutante. Tali risultati correlano funzionalmente le proteine individuate a SHP2, la quale è in grado di promuovere direttamente o indirettamente la loro defosforilazione. In particolare l’azione di SHP2 su MK14 può suggerire l’esistenza di un nuovo meccanismo molecolare che consente alla fosfatasi di regolare positivamente la via di segnalazione di RAS. Ulteriori informazioni riguardo gli interattori fisici di SHP2 sono state fornite da un approccio parallelo in cui il complesso fosfatasico è stato purificato e successivamente analizzato mediante spettrometria di massa. La strategia sperimentale descritta in questo lavoro può essere applicata per l’identificazione di substrati e/o interattori di altri membri della famiglia delle Tirosin Fosfatasi al fine di caratterizzarne funzioni cellulari ancora sconosciute.