Mechanisms of translational control during Rhabdovirus infection

Modulation of the host cell translational machinery by viruses is a crucial part of the virus strategy to replicate. Many viruses can selectively inhibit host translation and still use the host translation machinery to synthesize their own proteins. In particular, some rhabdoviruses cause a dramatic shut-off of host cell protein synthesis. Rhabdoviruses are enveloped RNA viruses widely distributed in nature, belonging to the Rhabdoviridae family. They represent the simplest of the non-segmented negative-stranded (NNS) RNA viruses, and have a wide host range, infecting reptiles, fish, insects, plants and mammals, including man. The main member of the Rhabdoviridae family is the rabies virus. Rabies is a disease diffused in the world and, even though there is an effective vaccine, the disease cannot be controlled because of the presence of the virus in wild animals. Vesicular Stomatitis virus (VSV) is the main model used in rhabdovirus experimental studies. Following viral penetration and uncoating, VSV primary mRNAs are synthesized in the host cell cytoplasm by the virus-associated RNA-dependent RNA polymerase. When viral proteins begin to accumulate, progeny viral genomes are replicated and used for secondary transcription. mRNA from both primary and secondary transcription are similar in structure to host messengers, containing a cap at the 5’-end and a 3’-poly(A) tail similar in length to host mRNAs. During VSV replication host translation is rapidly inhibited. The molecular basis of the mechanism causing the host protein synthesis shut-off is still largely unknown. The aim of this project was to investigate the mechanisms underlying the shut-off of cellular protein synthesis induced by VSV, with the double objective to elucidate the viral strategy for selective translation, and to identify novel targets for antiviral compounds interfering with viral protein expression. A key regulatory step during translation is the initiation, that requires several initiation factors. One of the rate-limiting factors of cap-dependent initiation during viral infection is the mRNA 5’ cap-binding protein eIF4E, a component of the eIF4F complex. Therefore most of this study was focused to analyze several signalling pathways that may lead to the alteration of eIF4E activity in our model. The results obtained suggest that VSV interferes with eIF4E at multiple levels: 1) inducing a transient eIF4E phosphorylation at 4 hours p.i.; 2) inducing 4E-BP1 dephosphorylation, an event that is known to lead to dissociation of eIF4E from the eIF4F complex, thus inhibiting host protein synthesis; 3) inducing at 2 hours p.i. the phosphorylation of HSP27, a small heat shock protein that has been recently involved in translation regulation, by modulating the availability of eIF4E and eIF4G for cap-dependent translation. These results indicate that this factor may play a key role in the virus-induced shut-off of the host cell protein synthesis. The mechanisms by which VSV is able to synthesize its proteins under these conditions is not known, even though it can be hypothesized that the peculiar viral mRNAs structure, characterized by short 5’-UTR regions lacking elaborate secondary structure, could be responsible for preferential translation. A second objective of the project was to identify antiviral molecules targeting viral protein expression. We have now identified different cycloxygenase (COX) inhibitors which interfere with VSV protein expression. Among these, we investigated the molecular mechanisms and the signalling pathways potentially involved in the antiviral activity of the non-steroidal antiinflammatory drug indomethacin. Indomethacin is a cyclooxygenase-1 and -2 inhibitor widely used in the clinic for its potent anti-inflammatory and analgesic properties. In addition to antiinflammatory/analgesic action, indomethacin also possesses antiviral activity against several human viral pathogens; however, the mechanism of the antiviral action remained elusive. We demonstrate that indomethacin acts at the translational level, by rapidly inducing the phosphorylation of the α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2), the multiprotein complex responsible for recruiting the initiator Met-tRNAi to the 40S ribosomal subunit in a GTP-dependent manner. We found that indomethacin directly activates the double-stranded RNA (dsRNA)-dependent protein kinase PKR, an enzyme that plays a critical role in the host antiviral defence and survival, causing rapid (< 5 minutes) phosphorylation of eIF2α. During VSV infection, PKR-mediated eIF2α phosphorylation resulted in shutting-off viral protein translation and blocking viral replication while protecting host-cells from virus-induced damage. Indomethacin did not affect eIF2α kinases PERK and GCN2, and was unable to trigger eIF2α-phosphorylation in PKR knock-out cells. In addition, small interfering RNA-mediated PKR-gene silencing prevented eIF2α phosphorylation and dampened the antiviral effect in indomethacin-treated human cells. The results identify PKR as a critical target for the antiviral activity of indomethacin and indicate that eIF2α phosphorylation could be a key element in the broad-spectrum antiviral activity of the drug.

Molti virus hanno evoluto sofisticate strategie per il controllo dell’apparato traduzionale della cellula ospite, in modo da bloccare la sintesi proteica cellulare e favorire la traduzione dei messaggeri virali. I meccanismi molecolari alla base di questo controllo sono in gran parte sconosciuti. Nel presente lavoro abbiamo studiato l’effetto dell’infezione virale su fattori cellulari che controllano l’inizio della traduzione cap-dipendente, usando come modello cellule di rene di scimmia MA104 infettate con il Virus della Stomatite Vescicolare (VSV), un rhabdovirus che è noto causare un blocco rapido e selettivo della traduzione degli mRNA cellulari. In particolare il nostro studio si è focalizzato sulle modificazioni indotte dal VSV al fattore di inizio della traduzione eIF4E. eIF4E è regolato sia direttamente, attraverso processi di fosforilazione, che indirettamente attraverso il legame con le proteine inibitorie 4E-BPs. L’infezione con VSV causava una marcata riduzione nei livelli di fosforilazione delle 4E-BPs, correlata al blocco dell’attività della chinasi mTOR, a partire da 4 ore p.i.. E’ noto che nello stato defosforilato le 4E-BPs legano eIF4E, impedendogli di entrare a far parte del complesso eIF4F funzionale. Abbiamo inoltre analizzato l’effetto dell’infezione con VSV sulla proteina da stress HSP27 che è stata recentemente implicata nella regolazione di eIF4E. L’analisi in Western blot ha dimostrato che l’infezione con il VSV è in grado di indurre a partire da 2 ore p.i. la fosforilazione di HSP27 associata all’attivazione della MAPK p38. Infine, oltre ai cofattori di eIF4E e HSP27, abbiamo dimostrato che il virus è in grado di indurre la fosforilazione transiente del fattore eIF4E stesso a 4 ore p.i.. Questi risultati indicano che il virus VSV ha evoluto diverse strategie per modificare la funzionalità di eIF4E, alterando il fattore ad almeno tre livelli diversi: 1) inducendo la defosforilazione delle 4E-BPs; 2) causando un aumento della fosforilazione della proteina HSP27; 3) modificando i livelli di fosforilazione del fattore stesso. E’ ipotizzabile che le diverse alterazioni prodotte dal virus siano necessarie per il reclutamento selettivo dei messaggeri virali nel complesso di inizio della traduzione eIF4F. Un secondo obiettivo del progetto è stato identificare molecole antivirali che agiserro sull’espressione delle proteine virali. In particolare abbiamo studiato i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione potenzialmente coinvolte nell’attività antivirale del farmaco anti-infiammatorio non-steroideo (NSAID) indometacina, nei confronti dell’espressione delle proteine del VSV. L’indometacina è un inibitore degli enzimi ciclo-ossigenasi 1 e 2 ampiamente usato in trattamenti clinici per la sua potente azione anti-infiammatoria e anti-dolorifica. Oltre ad avere attività antiinfiammatoria, l’indometacina ha anche un’azione antivirale nei confronti di molti patogeni virali umani; tuttavia, il meccanismo di azione antivirale non è ancora chiarito. Abbiamo dimostrato che l’indometacina agisce a livello della sintesi proteica, inducendo rapidamente la fosforilazione della subunità α del fattore di inizio traduzionale eIF2, il complesso multi proteico responsabile del reclutamento del tRNA iniziatore (Met-tRNAi) a livello della subunità ribosomale 40S in maniera GTP-dipendente. Abbiamo dimostrato che l’indometacina attiva in maniera diretta la chinasi PKR (dsRNA-dependent protein kinase), un enzima con un ruolo critico nella difesa dell’ospite nei confronti delle infezioni virali, causando una rapida (< 5 minuti) fosforilazione di eIF2α. Durante l’infezione con il VSV questa fosforilazione di eIF2α mediata da PKR induce il blocco della sintesi proteica virale e della replicazione virale, proteggendo inoltre la cellula ospite dall’effetto citopatico indotto dal virus. L’indometacina non modula la funzione delle altre chinasi di eIF2α PERK e GCN2, ed è risultata essere incapace di causare la fosforilazione di eIF2α in cellule knock-out per PKR. Inoltre, il silenziamento di PKR tramite RNA-interference in cellule umane previene la fosforilazione di eIF2α e impedisce l’effetto antivirale dell’indometacina. Questi risultati identificano PKR come un bersaglio critico per l’attività antivirale dell’indometacina, suggerendo che la fosforilazione di eIF2α possa essere un elemento chiave nell’attività antivirale ad ampio spettro di tale farmaco.