Immunogenicity of neuroblastoma tumors is controlled by impaired activity of NF-kB and IRF1 transcription factors

Low expression of major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules on the cell surface allows tumors to evade the host T cell-based immune response. These abnormalities are often related to either genetic defects of MHC I genes or aberrant expression of antigen processing machinery (APM) components. Neuroblastoma (NB), the most common solid extracranial cancer of childhood, is not an exception. MHC I surface expression is virtually undetectable in the most NB cell lines and primary tumors, and upregulated by gamma-interferon (IFN-γ). This phenotype is compatible with defects in the regulation of antigen processing and presentation components. In this study, the molecular mechanism underlying low immunogenicity in neuroblastoma was investigated. Amplification of the MYCN oncogene characterizes the most aggressive forms of NB and is believe to downregulate expression of MHC class I molecules. Although an inverse correlation between MYCN and MHC I has been reported in human NB cell lines, a direct demonstration of the MYCN-mediated down-regulation of MHC I expression has been questioned. Herein, we demonstrate that MYCN is not responsible for low MHC I, ERAP1 and ERAP2 protein levels in human NB cell lines, since their expression is not affected by neither transfection-mediated overexpression nor siRNA suppression of MYCN. Instead, we identified NF-kB and IRF1 as the main factors involved in the transcriptional regulation of MHC I and ERAPs proteins. By chromatin immunoprecipitation assay, we show a recruitment of p65 NF-kB to the MHC I, ERAP1 and ERAP2 promoters that is proportional with the expression of these genes. Moreover, low nuclear activity of both NF-kB and IRF1 factors correlated with the MHC I, ERAP1 and ERAP2-low phenotype of the most aggressive NB cell lines. Overexpression of either the transcription factors alone rescued the MHC I, ERAP1 and ERAP2-low phenotype, but only partially and in a cell-type depending manner. Important, the co-transfection of both NF-kB and IRF1 cooperated to strongly enhance the transactivation of MHC I, ERAP1 and ERAP2 in any cell lines. Notheworthy, NF-kB and IRF1 acted in a synergistic manner. We found an intriguing parallel in primary NB tumors, in fact, nuclear p65 was detected in the maturing neuroblastic cells (i.e. ganglionic cells) which express higher levels of MHC I molecules in human NB specimens. These findings provide molecular insight into defective MHC I expression in NB tumors and indicate that activating NF-kB and IRF1 in MHC I-low, aggressive NB cells could be instrumental for successful application of T cell-based immunotherapy.

La maggior parte dei tumori riescono ad evadere il sistema immunitario inibendo l’espressione di antigeni tumorali associati alle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità di classe I (MHC I) sulla superficie cellulare. La mancata espressione di questi complessi è spesso dovuta alla presenza di difetti strutturali dei geni codificanti le molecole MHC I, oppure all’aberrante espressione delle molecole responsabili del processamento degli antigeni legati alle molecole MHC I. Il neuroblastoma (NB), il tumore extracraniale solido più comune dell’infanzia, non è un’eccezione. Sia la maggior parte delle linee cellulari di NB, che i tumori primari esprimono bassi, se non nulli, livelli di MHC I che possono essere aumentati trattando le cellule con l’interferone-gamma (IFN-γ). Questo fenotipo è compatibile con la presenza di difetti nella regolazione trascrizionale delle molecole coinvolte nel processamento e nella presentazione dell’antigene. Il presente studio ha lo scopo di indagare il meccanismo molecolare che determina la mancata o ridotta espressione delle molecole MHC I, e delle due aminopeptidasi del reticolo endoplasmatico ERAP1 ed ERAP2. Le forme più aggressive di NB sono caratterizzate dall’amplificazione dell’oncogene MYCN. Sebbene una correlazione inversa tra l’espressione di MYCN le molecole MHC I nelle linee cellulari umane di NB sia stata riportata, un coinvolgimento diretto di MYCN nella regolazione di MHC I non è stato dimostrato. I nostri risultati dimostrano che MYCN non è responsabile dei bassi livelli di MHC I, ERAP1 ed ERAP2 nelle cellule di NB analizzate, infatti la loro espressione non è influenzata nè dalla forzata espressione ne dall’inibizione di MYCN. Abbiamo invece identificato due fattori di trascrizione, NF-kB e IRF1, che sono direttamente coinvolti nella regolazione delle proteine MHC I ed ERAPs. Mediante il saggio di immunoprecipitazione della cromatina abbiamo dimostrato che il reclutamento di p65 (una subunità di NF-kB) sui promotori di MHC I, ERAP1 ed ERAP2 è direttamente proporzionale all’espressione di questi geni. Inoltre, il fenotipo negativo per MHC I, ERAP1 ed ERAP2, caratteristico delle forme più aggressive di NB, coincide con una bassa attività nucleare di NF-kB ed IRF1. L’overespressione dei due fattori trascrizionali da soli è in grado di recuperare solo parzialmente l’espressione di MHC I, ERAP1 ed ERAP2, inoltre il risultato dipende dalla linea cellulare trasfettata. Comunque, la trasfezione contemporanea di NF-kB ed IRF1 produce un incremento sinergico dei geni target in tutte le linee trasfettate. Degno di nota è il fatto che l’espressione di p65 nei tumori primari di neuroblastoma è simile a quella osservata nelle linee cellulari. Infatti, solo le cellule gangliari, ovvero le cellule più differenziate presenti nel tessuto tumorale, esprimono sia l’MHC I che il p65 nucleare. Quindi, questo studio mette in luce il meccanismo molecolare responsabile della mancata espressione delle molecole MHC I, ERAP1 ed ERAP2 nei tumori di neuroblastoma più aggressivi fornendo un importante punto di partenza per lo sviluppo di protocolli immunoterapeutici più efficaci basati sull’utilizzo delle cellule T.