Impact of integrase polymorphisms and minor quasispecies in HIV-1 infected individuals naive or treated with strand-transfer integrase inhibitors: a refined analysis by cloning and 454-pyrosequencing techniques

Background: Raltegravir (RAL) is a very potent and effective strand-transfer integrase-inhibitor (InSti), recently FDA-approved for use also in first-line highly active antiretroviral therapy (HAART) regimen. Nowadays, by the available literature, the knowledge about the role either of integrase (IN) polymorphisms or HIV-1 minor quasispecies on virologic response and development of resistance to raltegravir is still poor. Therefore, the aim of this study is to explore the presence of InSti resistance mutations in HIV-1 quasispecies present in InSti-naïve patients and to evaluate their impact on in vitro phenotypic susceptibility to InSTIs, on replication capacities and on virologic response to raltegravir, by 3 different approaches: Cloning, population sequencing and ultra-deep 454 pyrosequencing (UDPS). Methods: For the clonal approach, the RT-RNase H-IN region was PCR amplified from plasma viral RNA obtained from 49 HIV-1 subtype B-infected patients (21 drug naïve and 28 failing HAART not containing InSTIs) and recombined with an HXB2-based backbone with RT and IN deleted. Recombinant viruses were tested against raltegravir and elvitegravir and for replication capacity. Three-hundred forty-four recombinant viruses from 49 patients were successfully analyzed both phenotypically and genotypically. For the population sequencing approach, we analyzed 206 multi-experienced patients that received raltegravir plus optimized background therapy (OBT) from eight clinical centres within Italy and France. HIV-1 RNA and IN genotypes were assessed at baseline and at failure. For 177 patients, viremia values at 24-week were available. The prevalence of baseline integrase mutations was calculated in the overall population, and in the responding and non-responding patients at 24 weeks. For polymorphisms with prevalence >5%, the codon usage of mutated amino acids were also considered. Logistic regression analyses (uni- and multivariate) were performed to investigate if baseline integrase polymorphisms and other variables (such as: baseline HIV-1 RNA, drugs in co-usage and/or subtype) were independent predictors of virologic response. For the UDPS approach a sub-group of 27 patients treated with raltegravir were genotyped by UDPS at baseline and at failure. IN phenotyping was also performed at baseline and during treatment for failing patients. In all three approaches, all IN mutations, with particular attention to known InSti resistance associated mutations, have been analyzed. The cut-off limit of reliable detection for UDPS was considered >0.1% (≥50 reads). Results: Regarding clonal analysis, the majority of clones were not phenotypically resistant to InSTIs: 0/344 clones showed raltegravir resistance, and only 3 (0.87%) showed low-level elvitegravir resistance. No primary resistance mutations for raltegravir and elvitegravir were found as major or minor species. Secondary mutations, such as T97A and G140S, found rarely and only as minority quasispecies, were present in the elvitegravir-resistant clones. A novel mutation, E92G, although rarely found in minority quasispecies, showed elvitegravir resistance. Regarding the analyses of baseline IN mutations, among the 206 patients genotyped by population sequencing, 186 (90.3%) patients were infected by HIV-1 subtype B versus 20 (9.7%) infected by non-B viruses (4A, 1C, 2D, 5F, 2G, 5CRF_02AG, 1CRF_12BF2). At week 24, 70% of patients achieved virologic response (71.3% [114/160] and 58.8% [10/17] infected by B and non-B viruses, respectively, p=NS). At baseline, all major raltegravir resistance mutations were completely absent, and secondary mutations (L74M, T97A, G140A, V151I, N155S, G163R) were present at very low frequency (≤1%). The presence at baseline of these secondary resistance mutations, as well as all other polymorphisms (with the exception of T125A, specific codon GCA, “see below”) did not statistically influence the virologic response among patients starting raltegravir (Fisher test, Benjamini-Hockberg correction). By multivariate logistic regression, the independent predictors of worse virologic response were: baseline viremia (OR=0.42 [CI:0.3-0.7], p=0.0003), AZT or D4T co-usage (OR=0.31 [CI:0.1-0.9], p=0.04) and baseline presence of polymorphism T125A (specific GCA codon, that is consensus sequence for subtypes A, C, D, G and for CRF02_AG) (OR=0.30 [CI: 0.1-0.7], p=0.006). Such prevalence of T125A (specific GCA codon) was higher in patients infected with non-B subtype (13/20 [65%]) vs B subtype (35/186 [19%]) (OR=0.12 [CI:0.05-0.33], P=0.00003), with a greater consistence among failing patients ( 6/7 [86%] non-B subtype vs 14/46 [30%] B subtype, OR=0.07 [CI:0.01-0.52],p=0.009). Regarding UDPS analyses, among >200,000 IN sequences analyzed, no minor variants of primary raltegravir mutations with a prevalence of >0.1% were found at baseline. The secondary mutations such as T97A, F121Y and V151I secondary mutations, were rarely found at baseline, in both failing- and success-group of patients, with a frequency ranging from 0.3 to 99% of viral species. Independently of the sequencing method, the presence of secondary-resistant species at baseline was not associated, at failure, with evolution at the same amino acid position or to specific primary raltegravir resistance mutations. Raltegravir phenotypic resistance has never been observed at baseline. At failure, all patients carrying primary mutations N155H, Q148H/R or Y143R, in presence of secondary (L74M, T97A, E92Q, G140S, V151I, E157Q, G163R, S230R) and novel (E92A, T112A) mutations, showed fold changes on susceptibility to RAL >30-100. Interestingly, in 1 patient, we found the combination of two primary mutations at failure, Y143C and N155H, by both population sequencing and UDPS. These mutations appeared at failure for >80% on same haplotypes, and showed a very high phenotypic resistance, particularly for raltegravir (FC raltegravir = 1255.3; FC elvitegravir = 625.3). Conclusion: By classic and ultra sensitive genotyping (and phenotyping) methods, pre-existing raltegravir resistance is a rare event in InSti-naïve patients, and when present, is confined to a restricted minority of secondary variants only. At baseline, only T125A mutation (specific GCA codon), higher prevalent in non-b subtype viruses, was associated with poorer virologic response to raltegravir. This finding in non-B subtypes is intriguing and further research is warranted. The clinical implications and relevance of this polymorphism is still to be determined. Overall, this study suggests that at this point IN genotyping in all patients before raltegravir treatment may not be cost-effective and should not be recommended until evidence of transmitted drug resistance to InSTIs or the clinical relevance of IN minor variants/polymorphisms is determined.

Introduzione: Raltegravir è un potente ed efficace inibitore dell’ integrasi (IN) di HIV-1, recentemente approvato dall’FDA anche nei regimi HAART di prima linea. Dagli studi attualmente disponibili in letteratura, il ruolo dei polimorfismi naturali e delle quasi specie minoritarie dell’integrasi sul responso virologico agli InSti e sullo sviluppo di resistenza durante il fallimento è ancora poco chiaro. Pertanto questo lavoro mira a verificare la presenza di mutazioni di resistenza agli InSti nelle quasispecie naturali di HIV-1 in pazienti naive a tali inibitori e a valutare l’impatto sulla suscettibilità fenotipica in vitro, sulla capacità replicativa virale e sul responso virologico a raltegravir utilizzando tre diversi approcci: il metodo clonale, il sequenziamento di popolazione e il pirosequenziamento massivo 454 (Ultra-deep 454 Pyrosequencing [UDPS]). Metodi: Per l’approccio clonale, le sequenze di RT-RNAse H-IN sono state amplificate tramite PCR da campioni di plasma da 49 individui infetti da HIV-1 sottotipo B (21 naive al trattamento e 28 in fallimento a regimi antiretrovirali non includenti gli InSti) e ricombinate con un vettore di espressione contenente lo stipite di HIV-1 HXB2D deleto della regione RT-IN. I virus ricombinanti ottenuti sono stati testati per la suscettibilità a raltegravir ed elvitegravir e per la capacità replicativa. Da 49 pazienti sono stati ottenuti 344 cloni ricombinanti testati genotipicamente e fenotipicamente in vitro. Per l’analisi con il sequenziamento di popolazione, sono stati analizzati 206 pazienti multi-trattati, provenienti da 8 diversi centri clinici italiani e francesi, che iniziavano il trattamento con un regime contenente raltegravir. Il genotipo dell’IN e la viremia sono stati effettuati prima e durate l’inizio della terapia. Alla 24esima settimana di trattamento erano disponibili valori di viremia per 177 pazienti. La prevalenza delle mutazioni è stata calcolata nella popolazione totale, nei pazienti che hanno raggiunto il successo virologico e nei i pazienti che hanno fallito alla 24esima settimana di trattamento. Per i polimorfismi con una prevalenza maggiore del 5% è stato anche considerato l’uso specifico dei codoni codificanti le mutazioni. Per valutare se i polimorfismi ed altre variabili (la viremia, i farmaci co-somministrati e il sottotipo) fossero predittori indipendenti di successo virologico, è stata effettuata un’analisi di regressione logistica (uni e multivariata). Per l’analisi con l’UDPS un sottogruppo di 27 pazienti trattati con raltegravir è stato genotipizzato al baseline e al fallimento. Inoltre è stato effettuato il test fenotipico delle popolazioni virali al fallimento. Per tutti e tre gli approcci sono state analizzate tutte le mutazioni dell’ integrasi con particore attenzione alle mutazioni di resistanza note. In particolare per l’UDPS, il rilevamento delle mutazioni è stato considerato attendibile osservando una prevalenza >0.1%(>50 varianti). Risultati: Dall’approcio clonale, la maggior parte dei cloni testati non ha mostrato resistenza fenotipica agli InSti: 0/344 cloni hanno mostrato resistenza per raltegravir e solo 3 cloni (0.87%) hanno mostrato bassi livelli di resistenza per elvitegravir. Non è stata osservata alcuna mutazione di resistenza primaria per raltegravir e/o elvitegravir. Nei cloni resistenti a elvitegravir sono state trovate alcune mutazioni secondarie, come la T97A e la G140S. Inoltre è stata osservata una nuova mutazione, E92G, anch’essa in quasispecie minoritaria, associata a resistenza fenotipica a elvitegravir. Tra i 206 pazienti analizzati con l’approccio di sequenziamento di popolazione, 186 (90.3%) sono risultati infetti da sottotipo B mentre 20 (9.8%) sono risultati infetti da sottotipi non B (4A, 1C, 2D, 5F, 2G, 5CRF_02AG, 1CRF_12BF2). Alla 24esima settimana di trattamento con raltegravir il 70% dei pazienti ha raggiunto il successo virologico (il 71.3% [114/160] e il 58.8% [10/17] infetti da virus di sottotipo B e non-B rispettivamente, p=NS). Al basale non è stata trovata alcuna mutazione di resistenza primaria mentre le secondarie (L74M, T97A, G140A, V151I, N155S, G163R) hanno mostrato una bassa frequenza (≤1%). La presenza al basale di tali mutazioni secondarie, come di altri polimorfismi (con l’eccezione della T125A, codone GCA, “vedi sotto”) non hanno influenzato statisticamente il responso virologico dei pazienti che hanno iniziato raltegravir (Fisher test, correzione di Benjamini-Hockberg). Dall’analisi di regressione logistica multivariata, i predittori indipendenti di negativo responso virologico erano: la viremia al basale (OR=0.42 [CI:0.3-0.7], p=0.0003), la co-somministrazione di AZT or D4T (OR=0.31 [CI:0.1-0.9], p=0.04) e la presenza al basale del polimorfismo T125A (specifico codone GCA, che è sequenza di riferimento per i sottotipi A, C, D, G and for CRF02_AG) (OR=0.30 [CI: 0.1-0.7], p=0.006). La prevalenza di questa mutazione, T125A(specifico codone GCA) risulta più alta nei pazienti infetti da sottotipi non-B (13/20 [65%]) vs B subtype (35/186 [19%]) (OR=0.12 [CI:0.05-0.33], P=0.00003) con una maggiore discrepanza tra i pazienti in fallimento ( 6/7 [86%] non-B subtype vs 14/46 [30%] B subtype, OR=0.07 [CI:0.01-0.52],p=0.009). Dall’approccio UDPS, al baseline, tra più di 200000 sequenze dell’IN analizzate, non è stata trovata alcuna variante minoritaria con resistenza primaria a raltegravir con una frequenza > 0.1%. Le mutazioni secondarie T97A, F121Y e V151I sono state trovate raramente e indifferentemente in pazienti in successo e/o in fallimento, con una frequenza compresa tra lo 0.3-99% delle specie virali. Indipendentemente dal metodo di sequenziamento utilizzato, la presenza di varianti resistenti secondarie al basale non correlava al fallimento, né con l’evoluzione alla stessa posizione amminoacidica, né con lo sviluppo di mutazioni primarie. Al basale non è stata osservata resistenza fenotipica a raltegravir, tuttavia al fallimento, i pazienti che hanno sviluppato le mutazioni primarie N155H, Q148H/R o Y143R, associate ad altre mutazioni secondarie (L74M, T97A, E92Q, G140S, V151I, E157Q, G163R, S230R) o non note (E92A, T112A) hanno mostrato un ridotta suscettibilita a raltegravir (Fold change >30-100). Di particolare interesse, in 1 paziente in fallimento, è stata trovata la combinazione delle mutazioni primarie N155H e Y143C, sia utilizzando il sequenziamento di popolazione sia l’UDPS. Queste mutazioni, apparse al fallimento nell’80% degli aplotipi del paziente, sono associate ad alta resistenza fenotipica particolarmente spiccata per raltegravir (FC raltegravir = 1255.3; FC elvitegravir = 625.3). Conclusioni: Dai saggi fenotipici e di genotipizzazione classici e ultra sensibili, la resistenza pre-esistente a raltegravir nei pazienti naive agli InSti è un evento raro e quando presente risulta confinato soltanto in quasi specie minoritarie secondarie. Al basale, solo la presenza della mutazione T125A(GCA), più prevalente nei sottotipi non-B, è risultata associata a un inferiore responso virologico a raltegravir. Questa osservazione nei sottotipi non-B è intrigante e necessita di ulteriori investigazioni. L’impatto clinico e la rilevanza di questo polimorfismo devono comunque ancora essere determinati. In conclusione, questo studio suggerisce che, allo stato attuale, effettuare il genotipo dell’integrasi in tutti i pazienti prima dell’inizio di raltegravir, potrebbe avere un rapporto costo-beneficio spostato verso il costo e non dovrebbe essere raccomandato, almeno fino a quando non si abbiano evidenze di resistenza trasmessa agli InSti o sia chiarita la rilevanza clinica dei polimorfismi e quasispecie minoritarie naturali.