Presso i laboratori dell’Università di Tor Vergata è stato sviluppato un sistema in vitro dotato di caratteristiche idonee allo studio dei meccanismi che sono alla base dello sviluppo e della progressione del melanoma. Tale sistema è costituito da una linea cellulare di melanoma umano, isolata da una lesione metastatica di una paziente e caratterizzata dalla capacità di crescere in adesione (linea TVM-A12), da cui sono state ottenute due distinte linee cellulari, dotate invece della caratteristica di crescita in sospensione, derivate l’una mediante tecnica della diluizione limite (Clonesp), e l’altra riducendo la concentrazione di siero dal 10% al 1% nel terreno di coltura (linea TVM-A12sp). Il passaggio dalla fase di crescita in adesione a quella in sospensione, osservato quando le cellule TVM-A12 erano poste in condizione di ridotta concentrazione di siero (1%) era accompagnato da riduzione di espressione dell’antigene melanocitico Melan-A/MART-1 e delle molecole HLA di classe I oltre che dall’aumentata capacità di formare colonie in terreno semisolido. Il cambiamento nella modalità di crescita delle cellule risultava inoltre associata all’aumento dell’espressione di HERV-K, sia a livello di mRNA che di proteine e poteva essere inibito dal blocco dell’espressione di HERV-K, ottenuto mediante RNA interference. Scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare le linee cellulari TVM-A12, parentale e di derivazione, dotate rispettivamente di capacità di crescita in aderenza ed in sospensione, al fine di chiarire i meccanismi che sono alla base dell’acquisizione del fenotipo dotato di maggiore aggressività ed individuare il ruolo dell’attivazione di HERV-K nella progressione del melanoma. A tale scopo, è stato condotto uno studio dell’espressione genica, mediante microarray, seguito da analisi in Real-Time PCR, che ha mostrato come la transizione fenotipica delle cellule, dalla fase di crescita in adesione a quella di crescita in sospensione, risultava accompagnata dalla modulazione di numerosi geni, che è noto essere coinvolti nell’acquisizione di caratteristiche di malignità. Inoltre il profilo di espressione delle cellule a crescita in sospensione, siano esse originate per diluizione limite o per riduzione della concentrazione di siero nel mezzo di coltura, risultava essere del tutto simile. Lo studio in Real-Time, utilizzato per confermare quanto osservato mediante microarray, ha mostrato che quando le cellule di melanoma iniziavano a distaccarsi dal monostrato, in presenza di FBS all’1%, i geni BHLHB2 e MYC risultavano transitoriamente attivati. Nelle cellule in presenza di bassa concentrazione di siero e durante il passaggio verso la fase definitiva di crescita in sospensione, i geni PTEN, VEFGA, CSK, PITCH1, FOXG1A e TP53 risultavano progressivamente up-regolati. Nelle cellule di melanoma che avevano acquisito la capacità di crescere stabilmente in sospensione, si osservava infine aumento di espressione dei geni WNT3, MYCN, MYCL1, BTK, CCND2, WNT2, TIMP3, IRF3, GTF2I, CTNNB1, E2F1, ARHGAP5, ARHGEF5, GPR39 e ITGB4. Riduzione di espressione dei geni ANXA7, CTNNA1, NME1, RRM1, CDKN1A, XRCC6, HDAC, TRAM1, CD59 e TOB1 veniva riscontrata invece nelle cellule ancora adese, in presenza di 1 % di siero ed in quelle già in sospensione, rispetto alla linea di origine mantenuta in condizioni di coltura standard (10%FBS). In questo studio è stato per la prima volta descritto un sistema cellulare in cui è stata dimostrata la correlazione tra aumento di espressione di HERV-K e acquisizione di un fenotipo più aggressivo, nonché la modulazione dei geni che in tali processi risultano coinvolti. Tale modello può fornire pertanto un utile strumento per la comprensione dei meccanismi che regolano lo sviluppo e la progressione del melanoma, nonché per la valutazione di agenti farmacologici e modulatori di geni attivi nei confronti dell’espressione di HERV-K e nella progressione del melanoma.

Al Dossary, R. (2010). Activation of human endogenous retrovirus K and cellular modifications in human melanoma cell lines: gene expression analysis.

Activation of human endogenous retrovirus K and cellular modifications in human melanoma cell lines: gene expression analysis

AL DOSSARY, REEM
2010-08-05

Abstract

Presso i laboratori dell’Università di Tor Vergata è stato sviluppato un sistema in vitro dotato di caratteristiche idonee allo studio dei meccanismi che sono alla base dello sviluppo e della progressione del melanoma. Tale sistema è costituito da una linea cellulare di melanoma umano, isolata da una lesione metastatica di una paziente e caratterizzata dalla capacità di crescere in adesione (linea TVM-A12), da cui sono state ottenute due distinte linee cellulari, dotate invece della caratteristica di crescita in sospensione, derivate l’una mediante tecnica della diluizione limite (Clonesp), e l’altra riducendo la concentrazione di siero dal 10% al 1% nel terreno di coltura (linea TVM-A12sp). Il passaggio dalla fase di crescita in adesione a quella in sospensione, osservato quando le cellule TVM-A12 erano poste in condizione di ridotta concentrazione di siero (1%) era accompagnato da riduzione di espressione dell’antigene melanocitico Melan-A/MART-1 e delle molecole HLA di classe I oltre che dall’aumentata capacità di formare colonie in terreno semisolido. Il cambiamento nella modalità di crescita delle cellule risultava inoltre associata all’aumento dell’espressione di HERV-K, sia a livello di mRNA che di proteine e poteva essere inibito dal blocco dell’espressione di HERV-K, ottenuto mediante RNA interference. Scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare le linee cellulari TVM-A12, parentale e di derivazione, dotate rispettivamente di capacità di crescita in aderenza ed in sospensione, al fine di chiarire i meccanismi che sono alla base dell’acquisizione del fenotipo dotato di maggiore aggressività ed individuare il ruolo dell’attivazione di HERV-K nella progressione del melanoma. A tale scopo, è stato condotto uno studio dell’espressione genica, mediante microarray, seguito da analisi in Real-Time PCR, che ha mostrato come la transizione fenotipica delle cellule, dalla fase di crescita in adesione a quella di crescita in sospensione, risultava accompagnata dalla modulazione di numerosi geni, che è noto essere coinvolti nell’acquisizione di caratteristiche di malignità. Inoltre il profilo di espressione delle cellule a crescita in sospensione, siano esse originate per diluizione limite o per riduzione della concentrazione di siero nel mezzo di coltura, risultava essere del tutto simile. Lo studio in Real-Time, utilizzato per confermare quanto osservato mediante microarray, ha mostrato che quando le cellule di melanoma iniziavano a distaccarsi dal monostrato, in presenza di FBS all’1%, i geni BHLHB2 e MYC risultavano transitoriamente attivati. Nelle cellule in presenza di bassa concentrazione di siero e durante il passaggio verso la fase definitiva di crescita in sospensione, i geni PTEN, VEFGA, CSK, PITCH1, FOXG1A e TP53 risultavano progressivamente up-regolati. Nelle cellule di melanoma che avevano acquisito la capacità di crescere stabilmente in sospensione, si osservava infine aumento di espressione dei geni WNT3, MYCN, MYCL1, BTK, CCND2, WNT2, TIMP3, IRF3, GTF2I, CTNNB1, E2F1, ARHGAP5, ARHGEF5, GPR39 e ITGB4. Riduzione di espressione dei geni ANXA7, CTNNA1, NME1, RRM1, CDKN1A, XRCC6, HDAC, TRAM1, CD59 e TOB1 veniva riscontrata invece nelle cellule ancora adese, in presenza di 1 % di siero ed in quelle già in sospensione, rispetto alla linea di origine mantenuta in condizioni di coltura standard (10%FBS). In questo studio è stato per la prima volta descritto un sistema cellulare in cui è stata dimostrata la correlazione tra aumento di espressione di HERV-K e acquisizione di un fenotipo più aggressivo, nonché la modulazione dei geni che in tali processi risultano coinvolti. Tale modello può fornire pertanto un utile strumento per la comprensione dei meccanismi che regolano lo sviluppo e la progressione del melanoma, nonché per la valutazione di agenti farmacologici e modulatori di geni attivi nei confronti dell’espressione di HERV-K e nella progressione del melanoma.
A.A. 2009/2010
Microbiologia medica e immunologia
22.
HERV-K; real-time PCR; gene expression; melanoma; malignant; cell transformation; microarray
Settore BIO/12
English
Tesi di dottorato
Al Dossary, R. (2010). Activation of human endogenous retrovirus K and cellular modifications in human melanoma cell lines: gene expression analysis.
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