Colorectal cancer (CRC) is the second most common cancer in developed countries. CRC could be escapable by interfering with the process of carcinogenesis that begins with an uncontrolled growth in the initiated cryptal cells, continues with the formation of an adenomatous polyp with or without dysplasia and, eventually, evolves into epithelial malignancy. The use of pre-clinical animal models mimicking the human carcinogenesis process became very significant because, understanding the molecular events associated to each tumoural steps, it could be possible to develop early therapeutic intervention. The preclinical animal model of CRC in BDIX rats set up in this work, developed all the carcinogenesis steps observed in human: inflammatory bowel disease, early and late adenoma, carcinoma in situ and advanced carcinoma. The immunohistochemical study of modification of various proteins implicated in the Wnt/β-catenin pathway (β-catenin, E-cadherin, APC, GSK3β, C-myc and Cyclin-D1) and K-ras showed a very similar expression and localization between human and animal tissues. The results obtained, confirmed the validity of our pre-clinical model for studying the CRC carcinogenetic process, and for developing new preventive or therapeutic strategies. Furthermore, because of the immune-competence of our experimental model, it could be useful for studying the relationships between tumour and the host immune-response as well as the mechanisms by which cancer cells escape immune-surveillance. CRC can escape the host immune-response also if the organism has an immune system able to react against the malignant cell or the whole tumour. In the tumour are infiltrating several immune-cells, but the most representative type is the T-lymphocyte, classified in two subsets. The Tumour-Infiltrating T-Lymphocytes (TIL, CD8+LAMP1+) are the true “effectors” of immune response, because they have the ability to destroy the recognized abnormal cell. The Regulatory T-lymphocytes (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) have important functions in order to control and/or inhibit the immune response when it isn’t necessary. The developing neoplasm can exploit and modify these mechanisms to own advantage. In effect, during the tumour progression T-reg are correlated in inverse proportion with the presence of TIL; TIL are more prominent in the early stages and decrease in the advanced stages of tumour, suggesting they are not able to eradicate a formed tumour. T-reg became most important just in the advanced stages: this is an indirect evidence that T-reg are involved in the immune-pathogenesis of cancer. In this work, we studied the balance between the two class of T-lymphocytes. We observed that the presence and distribution of T-reg and TIL around the neoplastic lesions reflect very well the equilibrium changes correlating to timing carcinogenesis observed in human CRC. These results indicate that our preclinical animal model is also suitable for immune-response studies, in particular to set up new protocols of tumor immunotherapy. Moreover, in this work we utilized a innovative proteomic approach to study simultaneously the activation state of several pathways involved in cell cycle, cell survival or apoptosis, proliferation and invasion in each different stage of carcinogenesis. A new phospho-proteomic technology, Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associated to Laser Capture Microdissection (LCM) permit the study of some post-translational modifications, specifically the phosphorylation that explain the functional cellular defects and elucidate the working state of cellular signal pathways. The obtained results are very promising because they showed a clusterization between early and late stages of tumoural lesions and some significant end point were individuated changing in a time depending manner. RPPAs provide the opportunity to generate a protein network map of known cell signaling or pathways for an individual patient that may serve as drug target for individualized or combinatorial therapy.

Il cancro colorettale (CRC) è il secondo tumore più diffuso nei paesi industrializzati. L’insorgenza del CRC potrebbe essere diminuita interferendo con il processo carcinogenetico stesso, che inizia con una crescita incontrollata delle cellule trasformate, continua con la formazione di un polipo adenomatoso con o senza displasia e, successivamente, evolve in una neoplasia maligna. L’utilizzo di un modello animale preclinico in grado di riprodurre la stessa progressione della carcinogenesi umana, diventa quindi molto importante poiché permetterebbe di studiare gli eventi molecolari associati ad ogni step di evoluzione neoplastica. Il modello animale preclinico di CRC nei ratti BDIX messo a punto in questo lavoro, ha riprodotto tutti gli stadi della carcinogenesi osservati nell’uomo: la malattia infiammatoria dell’intestino, l’adenoma precoce e tardivo, il carcinoma in situ e quello avanzato. L’analisi immunoistochimica delle modificazioni di varie proteine coinvolte nel pathway di Wnt/β-catenina (β-catenina, E-caderina, APC, GSK3β, C-myc e Ciclina-D1) e K-ras, ha mostrato un’espressione e localizzazione molto simile nei tessuti umani e animali. Questi risultati confermano la validità del modello che è quindi utilizzabile per sviluppare nuove strategie preventive e/o terapeutiche. Inoltre, data l’immunocompetenza dei ratti BDIX, il modello può essere usato anche per analizzare le relazioni immunitarie tra il tumore e l’organismo, in particolare il meccanismo attraverso cui le cellule neoplastiche sfuggono all’immunosorveglianza. CRC può infatti evitare la risposta immune anche se l’organismo ospite ha un sistema immunitario in grado di reagire contro le singole cellule maligne o l’intero tumore. Nella lesione neoplastica si infiltrano diverse cellule del sistema immunitario, ma le più rappresentative sono i linfociti T, classificati in due sottogruppi. I Linfociti-T Infiltranti il Tumore (TIL, CD8+LAMP1+) sono i reali effettori della risposta immunitaria, in quanto hanno la capacità di eliminare le cellule anormali riconosciute. I linfociti-T regolatorie (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) hanno importanti funzioni nel controllo o nell’inibizione della risposta immunitaria. Il tumore in crescita però, può evadere o sfruttare questi meccanismi a proprio vantaggio. Durante la progressione tumorale, le T-Reg sono correlate in maniera inversamente proporzionale alla presenza dei TIL; i TIL sono presenti negli stadi precoci ma diminuiscono drasticamente in quelli avanzati, suggerendo di non essere in grado di eradicare il tumore formato. Al contrario, le T-reg diventano elevate soltanto negli stadi avanzati, indicando indirettamente un loro coinvolgimento nell’immunopatogenesi del cancro. In questo caso è stato studiato il bilancio tra le due classi di linfociti T: la presenza e la distribuzione delle T-reg e dei TIL intorno alle lesioni neoplastiche riflettono consistentemente quanto osservato nella carcinogenesi umana. Questi risultati confermano che il modello può essere utilizzato per studi immunologici, ad esempio per mettere a punto nuovi protocolli di immunoterapia contro il cancro. Nel lavoro è stato utilizzato un’innovativa tecnica fosfo-proteomica per studiare contemporaneamente lo stato di attivazione di diversi pathway coinvolti nel ciclo cellulare, nella sopravvivenza cellulare o nell’apoptosi, nella proliferazione o nell’invasione, in ciascuno stadio della carcinogenesi. Infatti, la Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associata alla Laser Capture Microdissection (LCM), consente l’analisi delle modificazioni post-traduzionali ed in particolare della fosforilazione; quest’ultima mette in evidenza le cascate di attivazione/disattivazione dei diversi pathway nei vari tessuti. I risultati preliminari ottenuti sono molto promettenti in quanto mostrano una clusterizzazione degli stadi precoci da quelli tardivi delle lesioni tumorali; è stato anche osservato il cambiamento statisticamente significativo di alcune proteine in relazione alla progressione tumorale. L’RPPA quindi, consente di generare una mappa di signaling cellulare per ogni singolo paziente, che può essere sfruttata per disegnare farmaci target-specifici all’interno di protocolli di terapia individualizzata o combinata.

Moroni, N. (2010). Colorectal carcinogenesis: molecular and immunological events in a preclinical model.

Colorectal carcinogenesis: molecular and immunological events in a preclinical model

MORONI, NOEMI
2010-08-03

Abstract

Il cancro colorettale (CRC) è il secondo tumore più diffuso nei paesi industrializzati. L’insorgenza del CRC potrebbe essere diminuita interferendo con il processo carcinogenetico stesso, che inizia con una crescita incontrollata delle cellule trasformate, continua con la formazione di un polipo adenomatoso con o senza displasia e, successivamente, evolve in una neoplasia maligna. L’utilizzo di un modello animale preclinico in grado di riprodurre la stessa progressione della carcinogenesi umana, diventa quindi molto importante poiché permetterebbe di studiare gli eventi molecolari associati ad ogni step di evoluzione neoplastica. Il modello animale preclinico di CRC nei ratti BDIX messo a punto in questo lavoro, ha riprodotto tutti gli stadi della carcinogenesi osservati nell’uomo: la malattia infiammatoria dell’intestino, l’adenoma precoce e tardivo, il carcinoma in situ e quello avanzato. L’analisi immunoistochimica delle modificazioni di varie proteine coinvolte nel pathway di Wnt/β-catenina (β-catenina, E-caderina, APC, GSK3β, C-myc e Ciclina-D1) e K-ras, ha mostrato un’espressione e localizzazione molto simile nei tessuti umani e animali. Questi risultati confermano la validità del modello che è quindi utilizzabile per sviluppare nuove strategie preventive e/o terapeutiche. Inoltre, data l’immunocompetenza dei ratti BDIX, il modello può essere usato anche per analizzare le relazioni immunitarie tra il tumore e l’organismo, in particolare il meccanismo attraverso cui le cellule neoplastiche sfuggono all’immunosorveglianza. CRC può infatti evitare la risposta immune anche se l’organismo ospite ha un sistema immunitario in grado di reagire contro le singole cellule maligne o l’intero tumore. Nella lesione neoplastica si infiltrano diverse cellule del sistema immunitario, ma le più rappresentative sono i linfociti T, classificati in due sottogruppi. I Linfociti-T Infiltranti il Tumore (TIL, CD8+LAMP1+) sono i reali effettori della risposta immunitaria, in quanto hanno la capacità di eliminare le cellule anormali riconosciute. I linfociti-T regolatorie (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) hanno importanti funzioni nel controllo o nell’inibizione della risposta immunitaria. Il tumore in crescita però, può evadere o sfruttare questi meccanismi a proprio vantaggio. Durante la progressione tumorale, le T-Reg sono correlate in maniera inversamente proporzionale alla presenza dei TIL; i TIL sono presenti negli stadi precoci ma diminuiscono drasticamente in quelli avanzati, suggerendo di non essere in grado di eradicare il tumore formato. Al contrario, le T-reg diventano elevate soltanto negli stadi avanzati, indicando indirettamente un loro coinvolgimento nell’immunopatogenesi del cancro. In questo caso è stato studiato il bilancio tra le due classi di linfociti T: la presenza e la distribuzione delle T-reg e dei TIL intorno alle lesioni neoplastiche riflettono consistentemente quanto osservato nella carcinogenesi umana. Questi risultati confermano che il modello può essere utilizzato per studi immunologici, ad esempio per mettere a punto nuovi protocolli di immunoterapia contro il cancro. Nel lavoro è stato utilizzato un’innovativa tecnica fosfo-proteomica per studiare contemporaneamente lo stato di attivazione di diversi pathway coinvolti nel ciclo cellulare, nella sopravvivenza cellulare o nell’apoptosi, nella proliferazione o nell’invasione, in ciascuno stadio della carcinogenesi. Infatti, la Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associata alla Laser Capture Microdissection (LCM), consente l’analisi delle modificazioni post-traduzionali ed in particolare della fosforilazione; quest’ultima mette in evidenza le cascate di attivazione/disattivazione dei diversi pathway nei vari tessuti. I risultati preliminari ottenuti sono molto promettenti in quanto mostrano una clusterizzazione degli stadi precoci da quelli tardivi delle lesioni tumorali; è stato anche osservato il cambiamento statisticamente significativo di alcune proteine in relazione alla progressione tumorale. L’RPPA quindi, consente di generare una mappa di signaling cellulare per ogni singolo paziente, che può essere sfruttata per disegnare farmaci target-specifici all’interno di protocolli di terapia individualizzata o combinata.
A.A. 2009/2010
Microbiologia medica e immunologia
22.
Colorectal cancer (CRC) is the second most common cancer in developed countries. CRC could be escapable by interfering with the process of carcinogenesis that begins with an uncontrolled growth in the initiated cryptal cells, continues with the formation of an adenomatous polyp with or without dysplasia and, eventually, evolves into epithelial malignancy. The use of pre-clinical animal models mimicking the human carcinogenesis process became very significant because, understanding the molecular events associated to each tumoural steps, it could be possible to develop early therapeutic intervention. The preclinical animal model of CRC in BDIX rats set up in this work, developed all the carcinogenesis steps observed in human: inflammatory bowel disease, early and late adenoma, carcinoma in situ and advanced carcinoma. The immunohistochemical study of modification of various proteins implicated in the Wnt/β-catenin pathway (β-catenin, E-cadherin, APC, GSK3β, C-myc and Cyclin-D1) and K-ras showed a very similar expression and localization between human and animal tissues. The results obtained, confirmed the validity of our pre-clinical model for studying the CRC carcinogenetic process, and for developing new preventive or therapeutic strategies. Furthermore, because of the immune-competence of our experimental model, it could be useful for studying the relationships between tumour and the host immune-response as well as the mechanisms by which cancer cells escape immune-surveillance. CRC can escape the host immune-response also if the organism has an immune system able to react against the malignant cell or the whole tumour. In the tumour are infiltrating several immune-cells, but the most representative type is the T-lymphocyte, classified in two subsets. The Tumour-Infiltrating T-Lymphocytes (TIL, CD8+LAMP1+) are the true “effectors” of immune response, because they have the ability to destroy the recognized abnormal cell. The Regulatory T-lymphocytes (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) have important functions in order to control and/or inhibit the immune response when it isn’t necessary. The developing neoplasm can exploit and modify these mechanisms to own advantage. In effect, during the tumour progression T-reg are correlated in inverse proportion with the presence of TIL; TIL are more prominent in the early stages and decrease in the advanced stages of tumour, suggesting they are not able to eradicate a formed tumour. T-reg became most important just in the advanced stages: this is an indirect evidence that T-reg are involved in the immune-pathogenesis of cancer. In this work, we studied the balance between the two class of T-lymphocytes. We observed that the presence and distribution of T-reg and TIL around the neoplastic lesions reflect very well the equilibrium changes correlating to timing carcinogenesis observed in human CRC. These results indicate that our preclinical animal model is also suitable for immune-response studies, in particular to set up new protocols of tumor immunotherapy. Moreover, in this work we utilized a innovative proteomic approach to study simultaneously the activation state of several pathways involved in cell cycle, cell survival or apoptosis, proliferation and invasion in each different stage of carcinogenesis. A new phospho-proteomic technology, Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associated to Laser Capture Microdissection (LCM) permit the study of some post-translational modifications, specifically the phosphorylation that explain the functional cellular defects and elucidate the working state of cellular signal pathways. The obtained results are very promising because they showed a clusterization between early and late stages of tumoural lesions and some significant end point were individuated changing in a time depending manner. RPPAs provide the opportunity to generate a protein network map of known cell signaling or pathways for an individual patient that may serve as drug target for individualized or combinatorial therapy.
preclinical model; BDIX rat; TIL; T-Reg; colorectal calncer; RPPA; Wnt/β-catenin
Settore MED/04 - Patologia Generale
Settore MED/07 - Microbiologia e Microbiologia Clinica
English
Tesi di dottorato
Moroni, N. (2010). Colorectal carcinogenesis: molecular and immunological events in a preclinical model.
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