Le alterazioni dello splicing nei tessuti di pazienti con distrofia miotonica (DM): conseguenze fenotipiche e molecolari

Myotonic Dystrophy (DM) is caused by two different mutations: a CTG expansion in the 3’UTR region of the myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) gene (DM1; MIM # 160900) and a CCTG expansion in intron 1 of the zinc finger protein 9 (ZNF9) gene (DM2; MIM#602668), respectively, on chromosome 19q13 and 3q21. DM is an autosomal dominant disease that affects, besides muscle, many other tissue including eyes, heart, gall bladder, the endocrine system, and the central nervous system. However, DM1 and DM2 phenotypes, although strikingly similar, are not identical. For instance, DM2 does not shown a congenital form or the severe involvement of the SNC seen in DM1. The main pathogenic process at the basis of DM is a toxic RNA-gain of function effect of mutant ZNF9/DMPK transcripts which are retained in distinct ribonuclear foci within cells. A current model of the disease mechanism hypothesis that C/CUG expanded tracts alter the function of at least two RNA-binding proteins involved in the alternative splicing process: MBNL (muscleblind-like protein) and CELF (CUG-BP1 and ETR-3-like factors). These proteins regulate the same splicing events with opposite effects by binding to separate regulatory elements. It has been proposed that the MBNL loss of function, through a physical interaction with the repeats, and the CUG-BP1 protein increased steady state level, due to a PKC mediated nuclear hyperphosphorylation, act sinergically in the splicing misregulation of a wide group of developmentally regulated genes. The principal goal of this study was to analyze the in trans effect of CTG/CCTG repeats on skeletal muscle biopsies taken from DM patients, in particular has been thorough study of changes in the splicing of genes involved in the clinical phenotype of the DM and their correlation with the size of the expansions. A second aim of this study was to investigate the possible involvement of micro-RNAs (miRNAs) in the molecular pathogenesis of DM. In particular, the study was focused on myo-miRNAs, a family of miRNAs expressed primarily in skeletal muscle, which include the miR-1, miR-133 and miR-206. This work adds new elements in the knowledge of the pathogenesis of these complex genetic diseases.

La Distrofia Miotonica (DM) è la più comune forma di distrofia muscolare nell’adulto ed è causata da due mutazioni differenti. Una espansione CTG nella regione 3’UTR del gene DMPK (myotonic dystrophy protein kinasi) è responsabile della Distrofia Miotonica di tipo 1 (DM1; MIM# 160900), mentre un’espansione CCTG nell’introne 1 del gene ZNF9 (zink finger protein 9) è responsabile della Distrofia Miotonica di tipo 2 (DM2; MIM# 602668). La DM è una malattia a trasmissione autosomica dominante, multisistemica che coinvolge diversi apparati del corpo umano come il sistema endocrino, il cuore, i muscoli e gli occhi. Anche se il fenotipo clinico delle due malattie è sovrapponibile, la DM1 ha una prognosi più grave rispetto alla DM2, infatti la DM1 presenta forme congenite e il coinvolgimento del sistema nervoso centrale assenti nella DM2. Negli ultimi dieci anni sono state avanzate 3 teorie allo scopo di spiegare come le tri-tetraplette espanse nelle regioni non tradotte dei geni DMPK (nel 3’UTR) e ZNF9 (nell’introne 1) possano causare la DM. Ad oggi gli studi effettuati supportano che la teoria più accreditata sia quella dell’ “acquisto di funzione” dell’RNA espanso. L’RNA degli alleli espansi si accumula all’interno dei nuclei in foci discreti e qui si lega a determinate proteine inibendone la funzione nucleare. La DM1 e la DM2, infatti, pur avendo espansioni a carico di geni localizzati in regioni cromosomiche completamente differenti presentano un quadro clinico molto simile. La DM è il primo esempio di malattia dominante causata dal guadagno di funzione di RNA mutato. L’espansione C/CUGn presente sul messaggero del gene ZNF9 e DMPK ne impedisce l’esportazione dal nucleo e forma dei foci (accumuli discreti) nucleari evidenziabili tramite ibridazione in situ (FISH). Il trascritto mutato dei due geni altera la funzione e la localizzazione di proteine regolatori di splicing alternativo che sono essenziali al normale processamento dell’RNA. Nella DM sono coinvolte almeno 2 famiglie di “RNA binding proteins”: la famiglia CELF, (CUG-BP e ETR-3-like factors) e la famiglia delle MBNL (muscleblind-like proteins). La famiglia delle MBNL gioca un ruolo opposto a quello delle CELF nella regolazione degli splicing, con un effetto sinergico sulla patogenesi. E’ stato infatti dimostrato che la perdita della funzione delle proteine MBNL dovuta all’intrappolamento nei foci, e l’innalzamento dei livelli della proteina CUG-BP1 dovuta alla iperfosforilazione della PKC agiscano sinergicamente nella misregolazione degli splicing di un vasto gruppo geni. L’obiettivo principale di questa tesi di dottorato è quello di studiare l’effetto in trans causato dalle mutazioni responsabili della DM, su biopsie di muscolo scheletrico prelevate dai pazienti. In particolare è stato approfondito lo studio delle alterazioni dello splicing dei geni coinvolti nel fenotipo clinico della della DM e la loro correlazione con la grandezza delle espansioni. Un secondo obiettivo di questo lavoro è stato quello di approfondire il possibile coinvolgimento dei micro-RNA (miRNAs) nella patogenesi molecolare della DM. In particolare lo studio è stato incentrato sui myo-miRNAs, una famiglia di miRNAs espressi prevalentemente nel muscolo scheletrico, di cui fanno parte il miR-1, il miR-133 e il miR-206. Il lavoro di ricerca svolto ha portato alla pubblicazione di articoli scientifici di rilevanza internazionale che contribuiscono alla comprensione delle basi molecolari di queste complesse malattie genetiche.